单核细胞增生李斯特菌超氧化物歧化酶基因对氧胁迫的反应机制

本课题组前期研究发现，在一株菌膜形成量增高的单核细胞增生李斯特菌突变株中，氧胁迫基因sod的表达同时上调。为了揭示sod基因对氧胁迫的反应机制及其与菌膜形成的相关性，本项目将以野生型菌株单核细胞增生李斯特菌4b G为出发菌，构建sod基因缺失突变株，分析该基因缺失对菌株生长特性、菌膜形成能力和抗逆性的影响；利用基因表达芯片和蛋白双向电泳技术，比较亲本株和突变株在游离状态、菌膜状态和外界氧胁迫条件下的基因和蛋白的差异表达谱，并结合氧胁迫强度实验，探索sod基因在菌膜形成过程中对外界氧胁迫强度的耐受性。此外，通过反转录实时定量荧光PCR，对单核细胞增生李斯特菌不同血清型菌株中多个氧胁迫基因的表达情况进行监测分析，为找出氧胁迫基因在菌膜形成过程及外界氧胁迫条件下的反应机制提供数据支撑和实验依据。

以单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes 4b G）野生株和菌膜形成增强的突变株Δ1771（lm.G_1771基因编码ABC转运子透性酶）为基础，分别构建了sod基因缺失突变株Δsod和lm.G_1771、sod双缺失突变株Δ1771Δsod。利用96孔板结晶紫染色法和荧光显微法对野生型和三株突变株Δ1771、Δsod和Δ1771Δsod的菌膜形成能力、生长能力、活性氧组分（ROS）产量和抗氧胁迫能力进行了比较。与野生型和Δ1771相比，Δsod和Δ1771Δsod的菌膜形成和生长能力均明显减弱，ROS产量明显升高，对氧化剂甲基紫晶（MV）的敏感性显著增强，这些表型的变化在Δ1771Δsod中更显著。在10株野生型菌株中评估MV对菌膜形成能力的影响，结果显示1 mM MV可以明显抑制菌膜的形成，表明ROS不利于菌膜的形成。对比分析野生型和Δsod的蛋白质组，找到16个在Δsod中差异表达的蛋白，其中12个下调，4个上调。下调蛋白涉及细胞调节子、代谢、生长和压力反应；上调蛋白涉及代谢和细胞壁合成；部分差异蛋白在菌膜形成中起到重要作用。利用RT-qPCR技术分析抗氧胁迫相关基因在不同突变株中的表达，结果表明，游离状态下，Δ1771和Δsod中抗氧胁迫基因和反应调节子的表达均下调，而recA的表达无显著变化，但在Δ1771Δsod中，recA表达明显升高；而菌膜的形成会导致部分抗氧胁迫基因的上调，尤其在Δsod中，菌膜的形成有利于抗氧胁迫缺陷菌株抗氧能力的修复。选取血清型4b和1/2a野生型各6株，评价其菌膜形成和抗氧胁迫能力。结果表明，1/2a血清型菌株的平均菌膜形成能力显著高于4b血清型，而在对数生长期和长期存活期（20 d）内，4b血清型的平均抗氧胁迫能力高于1/2a血清型（＞2倍）。长期存活状态下（20 d）的4b血清型菌膜形成能力和抗氧胁迫能力呈现正相关性，而1/2a血清型则无此关联。RT-qPCR结果显示，抗氧胁迫相关基因sod、fri和perR的表达显示出较强的血清型差异（4b>1/2a），而recA的高表达对菌膜的形成至关重要。.总之，SOD在抗氧胁迫和维持细胞生长中发挥了重要作用，可抑制细胞过量产生ROS，对菌膜形成起到正调控作用，SOD与ABC转运子透性酶在抵御氧胁迫中具有协同作用。.