烟曲霉糖基磷脂酰肌醇修饰的调控及对毒力的影响机制

真核生物蛋白质的糖基磷脂酰肌醇（GPI）修饰是一种重要的糖基化修饰，在真核微生物表面的许多蛋白也是通过GPI锚定在质膜上而发挥其不同的作用，因而GPI脂锚成为研制抗真菌药物、发展抗宿主菌策略非常有意义的靶点。本研究拟采用转录组学与蛋白质组学结合的方法，研究两株与烟曲霉GPI生物合成相关的突变株，分析不同GPI生物合成突变株中的表达谱变化，结合突变株生长状态变化，糖链结构及功能变化，确定受GPI调控的下游效应因子；同时通过蛋白质组学研究，观察GPI生物合成基因缺失后对GPI锚定蛋白向细胞壁和膜转运的影响，动物实验验证GPI结构改变对菌株毒力的影响。从这两方面进行综合分析，揭示GPI影响烟曲霉生长和感染的作用机理，为发现有意义的药物靶点提供理论基础。

本项目采用分子生物学手段与转录组学结合的方法，研究与烟曲霉GPI生物合成相关的突变株在生理生化水平发生的变化及毒力分析，分析不同GPI生物合成突变株中的表达谱变化，同时结合对GPI锚定蛋白向细胞壁和膜的转运机制的研究，揭示GPI影响烟曲霉生长和感染的作用机理。目前已经很好的完成课题任务。 . 通过与酵母中的GPI生物合成相关基因比对检索，通过同源重组进行敲除的方法，获得两株与GPI生物合成相关的突变株，同时与Agilent公司合作成功制备烟曲霉全基因组表达谱芯片，分析烟曲霉突变株的表达谱。其中一株∆Afpiga被鉴定为GPI生物合成完全阻断，分析表明，烟曲霉GPI的合成是烟曲霉形态发生和致病性所必需的，突变株中细胞壁缺陷激活细胞壁完整性信号通路和GPI锚的减少导致了内质网胁迫，同时突变株中磷脂酰肌醇(PtdIns)的累积导致PtdIns信号途径被激活，最终导致自噬与坏死性凋亡通路的激活，细胞发生程序性死亡。.另外一株∆Afpig7推测为磷酸乙醇胺转移酶缺失突变株，阻断GPI前体的磷酸乙醇胺基团修饰加工。突变株分生孢子头形态异常并形成秃顶状，孢子萌发提前并出现随机出芽和分隔现象，尽管小鼠毒力无显著性差异，转录组数据分析表明，Afpig7基因的缺失分别影响了烟曲霉的生长萌发、毒力、细胞周期以及信号转导等。在对突变株细胞膜和细胞壁上的GPI蛋白群体研究发现，这些异常并不是由于GPI膜蛋白的错误定位引起，而是GPI锚定细胞壁蛋白的变化导致孢子形成能力减弱并影响细胞壁完整性，引起细胞周期的变化，导致孢子极性异常。. 此外，为了进一步挖掘GPI影响烟曲霉生长感染的机制，了解烟曲霉中糖基磷脂酰肌醇(GPI)在GPI锚定蛋白向细胞壁和膜的转运中的重要作用，本项目研究3个不同的烟曲霉GPI锚定蛋白在生物体内的定位，并将其C端定位信号及其特异位点突变信号与GFP的C端融合转化烟曲霉进行分析，发现烟曲霉中位于ω-1或ω-2位单碱性氨基酸可以作为将GPI蛋白定位在细胞膜的信号，而且烟曲霉AfMp1p中的C端GPI信号肽可被里氏木霉识别并用于介导外源蛋白的定向表达。