Glu信号通路在黑素细胞伪足形成及黑素小体转运中分子机制的研究

黑素小体转运是色素障碍性皮肤病及美容医学研究中的重要课题。但目前人们对黑素小体转运分子机制及其信号通路调控知之甚少。现已知分子马达Myo X参与黑素细胞丝状伪足形成及细胞间黑素小体转运；Myo Va参与细胞内黑素小体运输，且其构象及活性受细胞内钙离子浓度调控。我们前期研究发现Glu信号通路可调控黑素细胞的丝状伪足形成及细胞内钙离子浓度。为进一步阐明该通路在黑素小体运输及转运中的作用机制、明确其下游靶分子，本研究拟采用重组慢病毒载体及化学药物干预该信号通路；利用扫描电镜及视频时差显微技术，观察不同条件下丝状伪足形成及黑素小体转运的动态变化；以特异性抗体标记黑素小体、采用共聚焦显微镜及流式细胞仪进行黑素小体运输及转运的定量研究。建立豚鼠色素沉着动物模型，探讨体内该通路的作用机制。本研究预期结果将对深入了解色素障碍性疾病的发病机制、对色素性皮肤病的治疗及美容医学中新型美白剂的开发具有重要意义。

目的：探讨代谢型谷氨酸受体6（mGluR6）及肌球蛋白X（MyoX）对黑素转运的作用及其相关机制。.方法： 建立体外黑素细胞与HaCat角质形成细胞共培养体系。观察Lv-mGluR6-shRNA及Lv-m Myo X -shRNA转染后共培养体系中丝状伪足连接的变化；角质形成细胞中的黑素含量；黑素小体转运效率。转染后细胞骨架蛋白 β-tublin的分布变化..结果：1.在Lv-mGluR6-shRNA转染后发现黑素细胞树突变短，二、三级树突数量减少，细胞表面伪足数目明显减少。转染后的共培养体系中，相连接的丝状伪足数量明显减少。转染组角质形成细胞中黑素含量明显少于对照组。转染后角质形成细胞中的黑素小体数目明显减少；流式细胞术检测显示黑素小体在角质形成细胞中的含量随时间递增，与对照组相比，转染组转运效率明显下降。β-tublin抗体标记的细胞骨架蛋白在转染组和对照组有明显差异；转染组骨架蛋白呈点状分布，不呈网状结构相连接；对照组骨架蛋白成管束状分布均匀。2.MyoⅩ基因重组慢病毒转染后HaCaT细胞伪足数量减少。流式细胞术检测MyoⅩ基因重组慢病毒转染处理后HaCaT细胞吞噬微球能力降低。共聚焦显微镜检测MyoⅩ基因重组慢病毒转染处理后HaCaT细胞吞噬微球的数量的减少。.结论：1. mGluR6的表达与黑素细胞骨架蛋白分布及黑素细胞形态密切相关。 mGluR6的表达与共培养体系中丝状伪足的形成有关。 mGluR6的表达影响共培养体系中黑素小体的转运。mGluR6的表达影响黑素小体的转运。2. 首次发现下调mGluR6后HaCaT细胞表面伪足数量减少。与此同时细胞的骨架蛋白分布也发生明显变化，在核周的分布减少，多向细胞边缘聚集。 利用荧光微球成功模拟出HaCaT细胞吞噬黑素小体的模型。证明了HaCaT吞噬作用可能是黑素小体转运的一个重要机制。利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别定性和定量的检测出下调mGluR6后HaCaT吞噬荧光微球的能力下降。证明了mGluR6可能是影响HaCaT细胞吞噬作用的因素，发现了一个影响黑素小体转运的可能的新机制，为色素性疾病的基因治疗提供一个新的思路。3.MyoⅩ影响HaCaT细胞伪足的形成，下调MyoⅩ在HaCaT细胞中的表达，可以减少HaCaT伪足的形成，并能够降低其吞噬功能。