杜氏藻类胡萝卜素的降解对β-胡萝卜素积累的影响及其分子调控机制

Dunaliella bardawil can accumulate large amounts of β-carotene. Numerous researches on carotenoid biosynthesis and its molecular regulation in D. bardawil have been reported, however, the effects of carotenoid degradation on the accumulation of β-carotene have not been reported. Using D. bardawil as the object, this project focused on the relationship and regulation between the biosynthesis and degradation of carotenoid and elucidated the regulatory mechanism of high accumulation of β-carotene in D. bardawil at the molecular level. Firstly, carotenoid degradation related genes [encoding carotenoid cleavage dioxygenases (CCDs)] were cloned and functional identified from D. bardawil. Then, effect of carotenoid degradation on the accumulation of β-carotene were investigated through transcriptional level, cis-acting elements of promoter, and the addition of chemical inhibitors. Furthermore, effects of the presence of β-carotene degradation products on cell growth, β-carotene accumulation, and carotenoid-related gene transcription were investigated to reveal molecular regulatory mechanism of the promotion of β-carotene accumulation in the presence of degradation products. In conclusion, this project will have an in-depth understanding of gene expression and regulation of carotenoid synthesis and degradation as well as enrich and develop the theory of carotenoid metabolic pathways in D. bardawil.

杜氏藻能高度积累β-胡萝卜素，围绕其合成以及分子调控已有大量的研究报道，但类胡萝卜素降解对β-胡萝卜素的积累的影响及调控机制还未见报道。本项目以巴氏杜氏藻为研究对象，围绕类胡萝卜素合成与降解之间的关系与调控，从分子水平上阐明杜氏藻高度积累β-胡萝卜素的调控机制。首先克隆类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCDs，再鉴定其功能活性，然后从转录水平、启动子顺式作用元件以及添加化学阻断剂来探讨类胡萝卜素降解对β-胡萝卜素积累的影响。同时探讨β-胡萝卜素降解产物的存在对巴氏藻细胞生长、β-胡萝卜素积累以及类胡萝卜素相关基因转录水平的影响，通过优化最佳的降解产物浓度、添加时机和处理时间，提高巴氏藻β-胡萝卜素含量，并揭示降解产物的存在促进β-胡萝卜素积累的分子调控机制。总之本项目将深入了解杜氏藻类胡萝卜素合成与降解的基因表达与调控规律，丰富和发展杜氏藻类胡萝卜素生物代谢途径的理论和范畴。

杜氏藻是生产天然类胡萝卜素的优质生物资源，同时也是研究类胡萝卜素代谢和耐盐机制的模式生物。目前围绕其类胡萝卜素合成以及分子调控已有不少研究，但β-胡萝卜素的下游途径相关基因以及类胡萝卜素降解调控机制还有待研究。本项目以高产类胡萝卜素的巴氏杜氏藻为研究对象，围绕类胡萝卜素合成与降解之间的关系与调控，研究杜氏藻β-胡萝卜素的下游途径相关酶功能、类胡萝卜素降解的调控机制、降解产物的存在对其细胞生长和色素积累的影响及相关机制。.通过在大肠杆菌中采用基因功能互补实验，鉴定了巴氏藻中的两个番茄红素环化酶（DbLcyB和DbLcyE，具有β-和ε-环化酶的双功能酶活性）、两种类型的胡萝卜素羟化酶（DbBCH和DbCYP97s，DbBCH同时羟化β-和α-胡萝卜素，DbCYP97A和DbCYP97C具有较专一的催化活性）、三个类胡萝卜素裂解双加氧酶（DbCCDs，DbCCD1A/B和DbCCD8，均能裂解β-胡萝卜素，降解产物还有待进一步鉴定）的功能。在一定程度上解释了巴氏藻积累叶黄素和α-胡萝卜素的机理。.经产物检测发现高盐胁迫促进巴氏藻类胡萝卜素降解，主要产生β-环柠檬醛、β-和α-紫罗兰酮等降解产物。经荧光定量PCR分析发现DbCCDs基因的表达与类胡萝卜素降解情况不相关，说明同时存在酶降解和非酶降解途径。.在巴氏藻培养过程中添加β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛，发现低浓度β-紫罗兰酮可作为胁迫信号分子，高浓度的β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛会作为生长抑制剂抑制巴氏藻生长和色素积累。10 mg/L β-紫罗兰酮处理巴氏藻引起脂质过氧化产物MDA水平的升高，抑制多个重要能量代谢过程的相关基因表达，但显著上调有关细胞膜生物合成的基因表达，表明巴氏藻细胞从活跃的生长状态转向细胞膜的生物合成。而10 mg/L β-环柠檬醛处理巴氏藻会下调细胞生长、光合作用和胁迫响应等相关基因的表达，这可能是因为高浓度ROS积累引起氧化还原稳态失衡和细胞损伤的结果。.本项目丰富和发展杜氏藻类胡萝卜素代谢途径研究的理论和范畴，更全面更系统地了解杜氏藻类胡萝卜素合成与降解的基因表达与调控规律。