杜氏藻外源基因表达系统的构建与β-胡萝卜素合成途径的延伸

Due to the defects such as unable to express photosynthetic related genes, traditional microbial gene expression systems, such as Escherichia coli and yeast expression systems, are no longer sufficient enough for the research filed. Microalgae, which possess the characters of both microorganisms and plants, are becoming increasingly attractive in the construction of exogenous gene expression systems since they have the advantages of both microorganism and plant systems. Unicellular microalgae Dunaliella has very high content of beta-carotene and is also one of the most halotolerant eukaryotic organisms. It has no cell wall, can be cultivated in saline water, not easily contaminated, and therefore is readily applicable to exogenous gene expression systems. The applicant initiated the stable expression of exogenous genes in Dunaliella, a key technical challenge once faced the research field concerning the application of Dunalielle to gene expression system. In this project, genes encoding key enzymes in the carotenoid metabolic pathway in Dunaliella will be cloned, among which high efficient endogenous promoters will be screened out to construct an exogenous gene expression system with high activity and high expression level. To achieve the goal of accumulating astaxanthin in Dunaliella, two key genes encoding astaxanthin, HBFD and CBFD, will be introduced in the system stated above to form a metabolic pathway with beta-carotene as the starting materical and astaxanthin as the end product, base on which to verify the function of Dunaliella exogenous gene expression system. The goal of the research will also help lay the groundwork for future investigations on other active substances in this system. The project will enrich and develop the theory and practice of exogenous gene expression system, and has potential application value.

大肠杆菌和酵母基因表达系统由于无法表达光合作用相关基因等缺陷，无法满足需求。微藻兼有微生物和植物的特点，是基因表达系统的重要方向。单细胞杜氏藻是β-胡萝卜素含量最高的生物、最耐盐的真核生物。由于无细胞壁、适合高盐培养不易染菌等特点，使其外源基因表达系统更易于实际应用。申请人在国际上率先实现了外源蛋白在杜氏藻中的稳定表达，解决了杜氏藻作为基因表达系统的关键技术难题。本项目从我们克隆的杜氏藻类胡萝卜素代谢途径关键酶基因的启动子中，筛选高效内源性启动子，构建具有高活性和高表达量的杜氏藻外源基因表达系统。在此基础上，通过引入2个外源虾青素高效合成的关键酶基因HBFD和CBFD，构建以β-胡萝卜素为起始物、虾青素为终产物的虾青素代谢途径，对杜氏藻外源基因表达系统的功能进行验证，实现虾青素在杜氏藻中的积累。为表达其他各类活性物质打下基础。项目将丰富和发展外源基因表达系统的理论和实践，有潜在的应用价值。

虾青素是一种天然生物色素，是类胡萝卜素生物合成途径中的终产物，广泛存在于虾、蟹壳中，具有很强的生物活性，是迄今为止人类发现自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有的抗氧化剂。虾青素的用途很广，在保健、食品、药品、高档化妆品等方面均有很大需求和应用前景。.目前市场上的虾青素主要由化学方法合成，但化学合成虾青素的可吸收性和抗氧化能力都比天然虾青素低。天然虾青素能在某些微藻细菌和真菌中产生，动物和植物一般不能合成虾青素，但虾、鲑鱼、鳟鱼等水生动物能通过摄食这些微生物在体内积累虾青素。目前天然虾青素生产主要利用水产品废弃物以及红发夫酵母和雨生红球藻等微生物。. 植物一般不能合成虾青素，但作为特例夏侧金盏花（Adonis aestivalis）的花瓣中含有虾青素含量为花瓣干重的1%左右，且虾青素占类胡萝卜素总量的80%以上。但夏侧金盏花的花器官小，花瓣生物量低，且主要分布在我国东北和西北等冷凉地区，因此难以达到商业化生产的要求。夏侧金盏花虽然不适合直接用于虾青素生产，但却为发掘植物虾青素合成相关基因、研究植物虾青素合成途径提供了理想材料。. 目前已从夏侧金盏花中鉴定了2个虾青素合成相关基因HBFD (carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase gene)和CBFD (carotenoid β-ring 4-dehydrogenase gene)。夏侧金盏花CBFD蛋白与其它植物的类胡萝卜素羟化酶CHYb具有较高相似性，如CBFD与拟南芥CHYb在催化功能区的相似性大于60%，但CBFD并不表现为羟化酶活性，而是具有在β-环的C-3,4位去饱和以及在C-4位羟化2个作用。HBFD与CBFD共同作用可以将β-胡萝卜素转化为虾青素，但目前还只在大肠杆菌中得到验证[7]。在本研究中，利用代谢工程手段，在不能自身合成虾青素而含大量β-胡萝卜素的巴氏杜氏藻中，通过引入夏侧金盏花的2个虾青素合成相关基因HBFD和CBFD，以改变巴氏杜氏藻中类胡萝卜素的合成途径，实现由β-胡萝卜素转化为虾青素，为构建高产虾青素的藻株打下理论基础，为天然虾青素的生产开辟了一条新的途径。