NEP1-40基因工程神经干细胞促脊髓损伤修复的机制研究

It has important significance to promote neural axon regeneration for the treatment of spinal cord injury (SCI). Nogo receptors (NgR) is the common targets of axon regeneration factor. NEP1-40 can close Nogo receptors (NgR), but not activate Rho signaling pathways and promote the growth of axons. We use lentivirus transduce NEP1-40 gene into neural stem cells (NSC) and find neurons which has differentiated can obviously against NogoA inhibition for the growth of axons. It can promote the function recovery of SCI. On testing of some key genes of Rho pathways, We found its expression level update. It hint there is an different mechanisms to regulate neurons axon growth which differentiated from NEP1- 40 NSC.We suppose NEP1-40 NSC promote the function recovery of SCI because of promoting axon growth of neurons which differentiated from it and located injuried area through different mechanism In addition to cell  supplement . This topic proposed in vitro observation NEP1 - 40 NSC influence on two kinds of neurons axon under the NogoA intervention. The key parts of Rho signal transduction pathways and regulation of the growth cone downstream factors in the aspect of gene and protein level, degree of phosphorylation were observed.  The spinal cord function recovery and change of the Rho signal transduction pathways were observed after NEP1-40 NSC implantation in SCI animal. It may be found possible mechanisms of promoting the repair of SCI with NEP1-40 NSC.

促进神经轴突再生对脊髓损伤（SCI）治疗有重要意义。Nogo受体（NgR）是抑制轴突再生因子的共同作用靶点，NEP1-40能通过封闭NgR抑制Rho信号通路而促进轴突生长。我们前期用慢病毒载体将NEP1-40导入神经干细胞（NSC)内，分化后的神经元能明显对抗NogoA对轴突生长的抑制作用，并可促进脊髓功能恢复。但Rho通路的一些关键基因表达上调，提示其分化后的神经元轴突生长受不同机制调控。因此设想除了细胞代替作用外，其通过不同机制调控损伤区和自身分化后神经细胞的轴突生长而促进SCI再生修复。本课题拟构建NEP1-40 NSC，体外观察在NogoA干预下其对背根节神经细胞和自身分化后神经元轴突生长的影响，在基因、蛋白质及磷酸化水平对Rho信号通路的关键部位及下游调控生长锥因子进行检测。并将其移植入SCI动物体内，观察脊髓功能恢复情况和Rho信号转导通路变化，探讨其机制。

脊髓损伤（spinal cord injury SCI）可导致损伤部位神经元死亡、轴突变性和脱髓鞘等变化，促进神经轴突再生、再建损伤轴突与其支配靶器官联系，引导脊髓功能恢复对SCI 的治疗有重要意义。在轴突再生抑制方面的研究发现，神经纤维在中枢神经损伤后局部有短时间修复反应，其轴突再生和轴突发育过程一样可以通过移动生长锥形成突触联系，但却不能生长，与受损部位存在相关抑制因素有关。前期采用慢病毒载体介导NEP1-40基因修饰神经干细胞治疗脊髓损伤，促进其再生与修复，克服了NEP1-40蛋白与神经干细胞的各自不足，可以使被修饰后的神经干细胞能更好发挥修复脊髓的功能。本研究在体外研究NEP1-40基因工程NSC 对背根节神经细胞和分化后的自身神经元轴突生长的影响，对Rho信号转导通路的关键部位及 Rock基因下游多种调控生长锥的蛋白质底物在基因、蛋白质水平、磷酸化程度方面进行检测。并将NEP1-40基因神经干细胞移植入脊髓横断损伤动物模型体内，观察各组脊髓功能恢复情况，并检测Rho信号转导通路的变化，探讨NEP1-40基因工程NSC促进脊髓修复的可能机制。 本研究结论包括：1、成功构建NEP1-40基因工程神经干细胞，在转录和翻译水平以及细胞外均检测到NEP1-40因子的大量表达；2.NEP1-40-NSCs在体外能够诱导分化为神经元和胶质细胞，并显著提高大鼠海马神经元细胞的存活率；3.NEP1-40-NSCs能够克服Nogo-66的抑制作用，促进与其共培养的海马组织神经元轴突的延长，影响生长锥的结构发育，并且其作用机制可能是通过调控LIM激酶，Cofilin和MLCⅡ的磷酸化水平实现促进轴突生长从而实现修复脊髓损伤的效果。4.在动物实验中也初步证实NEP1-40基因工程神经干细胞分泌NEP1-40 抑制损伤区神经细胞Rho信号转导通路，促进轴突生长。该研究为后续深入探讨轴突再生机制有一定意义。