基于化学蛋白组学策略分离和鉴定杠柳毒素作用于昆虫中肠细胞的靶蛋白

以活性天然产物为探针，探索或发现新的作用靶标，特别是研究作用于昆虫中肠的新靶标，是国际上药剂毒理学的前沿课题。本项目应用化学蛋白组学策略，以杠柳毒素NW为探针，采用荧光标记示踪与亲和层析分离方法，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解吸/电离时间飞行质谱（MALDI-TOF）、串联质谱（MS/MS）以及生物信息学的手段，分离和鉴定杠柳毒素NW作用昆虫中肠细胞膜上的靶蛋白。这可能在昆虫中肠发现一类新型作用靶标，为从分子水平阐明杠柳毒素NW的杀虫作用机理及创制一类新型昆虫消化毒剂奠定基础。

项目目标是分离和鉴定植物源农药杠柳杀虫活性成分（杠柳毒素）作用昆虫的靶蛋白并阐明其杀虫机制，为新农药创制提供靶标分子模型。.项目基于化学蛋白组学的原理，应用杠柳新苷P的N-甲基靛红酸酐标记、杠柳新苷E亲和柱层析以及杠柳新苷T作用粘虫中肠BBMV的蛋白组学研究等方法，从粘虫中肠细胞分离、鉴定了杠柳杀虫活性成分的结合蛋白，通过生物信息学技术对结合蛋白进行功能分析，确定其疑似靶标蛋白为V-ATP酶A亚基、胰蛋白酶和氨肽酶；克隆、异源表达并纯化了V-ATP酶A亚基和胰蛋白酶；发现杠柳新苷活性化合物对表达后纯化粘虫胰蛋白酶的作用并不显著，应用实时定量PCR证实具杀虫活性杠柳新苷化合物主要是提高了粘虫胰蛋白酶的表达量；采用电生理技术分析了杠柳杀虫活性成分PSP作用昆虫后对其中肠跨膜电位的影响，证实PSP可能直接作用昆虫中肠肠壁细胞顶膜，推测其靶蛋白很可能是中肠顶膜杯状细胞膜的V-ATP酶，PSP直接干扰中肠细胞顶膜上基于V-ATP酶偶联的H+转运体系的功能；比较分析了PSP对埃及伊蚊马氏管液体分泌的抑制作用及分泌液体的物质组成，测定了PSP对马氏管V-ATP酶活性的影响，发现PSP可能是一个V-ATP酶抑制剂，进而从功能上进一步明确了其作用靶标可能是V-ATP酶。.本项目基于化学蛋白组学结合功能验证，首次揭示V-ATP酶是杀虫剂作用新靶标，具有原创性。.本项目发表SCI论文5篇，国内刊物11篇，获得国家发明专利1项，培养硕士11名。