杠柳新苷X激活昆虫胰蛋白酶的机理研究

昆虫胰蛋白酶由中肠肠壁细胞产生分泌，在消化食物蛋白质过程中起着重要作用。但迄今为止对其激活机理的研究仍属空白。前期研究表明杠柳新苷X能显著激活胰蛋白酶的活性，使昆虫中场消化道破坏。本项目拟通过对粘虫胰蛋白酶基因及其结构的研究，探索杠柳新苷X活化胰蛋白酶的机理。采用凝胶柱层析、mRNA RT-PCR 差异显示、电喷雾多级质谱和基质辅助激光解吸电离多级质谱等技术阐明杠柳新苷X对粘虫胰蛋白酶的基因调控和酶自身活化机理，为进一步开发以此为靶标的杀虫剂奠定基础。

昆虫胰蛋白酶由中肠肠壁细胞产生分泌，在消化食物蛋白质过程中起着重要作用。项目以粘虫胰蛋白酶为研究对象，探索了杠柳新苷活性化合物P,T对其激活作用的作用机制，取得了以下研究结果：.1 采用两种专性底物BApNA 和 TAME比较研究了杠柳新苷P、T和无活性的E 3种化合物在活体条件下对粘虫Mythimna separata和小地老虎Agrotis ypsilon六龄幼虫中肠胰蛋白酶活性的影响。结果表明：杠柳新苷P对粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶具有强激活作用，激活时间长达8 h，药后2-8 h酶比活力分别为对照的2.69，1.96，3.43倍，杠柳新苷T对粘虫强碱性和弱碱性胰蛋白酶均有激活，特别是对弱碱性胰蛋白酶有较强的激活作用，激活时间长达24 h，酶比活力为对照的3.78倍。.2 采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel离子交换柱层析、Sephacryl S-100 HR 凝胶过滤层析和苯甲脒亲和层析分离纯化得到粘虫中肠类胰蛋白酶，测定其相关性质，研究三种杠柳新苷化合物对纯化后粘虫胰蛋白酶活性的影响。结果表明杠柳新苷P和T对纯化的粘虫胰蛋白酶有激活作用，以BApNA为底物时，激活率分别为22.7%与20.3%；以TAME为底物时，激活率分别为28.07%和31.7%，且均无浓度依赖性。杠柳新苷E对纯化后的粘虫胰蛋白酶没有明显影响。表明胰蛋白酶本身可能不是其直接作用的靶标。.3 以GenBank中已有的昆虫胰蛋白酶核苷酸序列为基础，采用RACE技术完成了粘虫中肠胰蛋白酶的cDNA克隆，得到的胰蛋白酶全序列为933bp，包括非编码区81bp，蛋白质编码区764bp，3’端非编码区88bp。.（4）采用实时定量PCR技术研究了杠柳新苷化合物对粘虫中肠胰蛋白酶表达的影响。结果表明：杠柳新苷P和T对粘虫胰蛋白酶的表达均有激活作用，药后5h分别为对照的3.72倍和5.55倍，杠柳新苷E、胰蛋白酶抑制剂PMSF和大豆胰蛋白酶抑制剂对其表达均无影响。.（5）完成了粘虫中肠胰蛋白酶的原核表达，初步探讨了杠柳新苷P和T与酶结合的影响.由以上研究结果可以看出杠柳新苷P，T可能激活粘虫胰蛋白酶基因的转录，从而提高了昆虫胰蛋白酶的表达量，干扰了正常的代谢机制，引起试虫死亡，而胰蛋白酶自身不是其主要作用靶标。对于杠柳新苷P，T基因转录调控作用机理还有待进一步研究。