基于Split-GFP技术的幽门螺杆菌IV型分泌系统效应蛋白鉴定及转运识别机制研究

Type IV secretion system (T4SS) is considered as an important virulent factor of Helicobacter pylori (H. pylori), playing a key role in H. pylori pathogenesis. In recent years, numerous studies have focused on the composition and function of T4SS. However, except CagA, the other effector proteins of T4SS and their translocation process are not clear. In this project, Split-GFP (green fluorescent protein) technology based on the principle of bimolecular fluorescence complementation will be used to study the translocation of H. pylori proteins. Establishment and optimization of method to detect injection of effector proteins through H. pylori T4SS into receptor cells, which will provide an effective tool in H. pylori T4SS study. Based on this method, the hypothetical effector proteins on Cag PAI will be identified. Finally, the recognition sequence of H. pylori T4SS will be further analyzed. These findings would be beneficial to reveal the mechanism of protein translocation by T4SS and pathogenic mechanism of H. pylori infection.

Cag致病岛编码的IV型分泌系统（T4SS）已逐渐成为公认的幽门螺杆菌（H. pylori）重要的毒力因子，与致病、致癌作用紧密相关。大量的研究试图揭示H. pylori T4SS的蛋白组成、结构与功能，然而对其除CagA以外的效应蛋白以及效应蛋白的识别、转运机制还不清楚。本项目将基于双分子荧光互补原理的GFP拆分（Split-GFP）技术应用到H. pylori的蛋白转运研究中，建立并优化Split-GFP技术用于T4SS效应蛋白转运研究的检测方法，为H. pylori T4SS及效应蛋白的深入研究提供有效手段；在此基础上，逐一分析Cag致病岛编码的潜在效应蛋白能否通过T4SS转运到宿主细胞中，以期发掘H. pylori T4SS新的效应蛋白；进一步分析T4SS对效应蛋白的转运识别序列，揭示蛋白转运识别机制，为深入了解H. pylori T4SS的蛋白转运机制及其致病、致癌作用奠定基础。

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）Cag致病岛（Cag PAI）编码的IV型分泌系统（T4SS）和CagA蛋白是其重要的致病因子。近来研究表明T4SS除了参与CagA向受体细胞转运之外，自身也具有致病作用，但是对于其结构组成及功能还不够清楚，其能否转运CagA以外的效应蛋白及其对效应蛋白的识别、转运机制也不清楚。.Split-GFP方法基于双分子荧光互补原理，巧妙地将GFP拆分为1-10 β折叠和11β折叠两部分，二者可以重新结合组成完整的GFP蛋白发出荧光。通过这种GFP的拆分和组合可以实现对效应蛋白通过分泌系统转运的可视化研究。.本研究的主要内容是将Split-GFP方法应用到H. pylori的T4SS蛋白转运研究中。首先将GFP的11β折叠锚定到CagA蛋白上，将1-10 β折叠在受体细胞AGS和GES-1内表达，在细菌-细胞共培养中检测到了CagA蛋白通过T4SS转运到受体细胞后的荧光现象，解决了以往研究中利用完整GFP示踪CagA蛋白转运使得其无法通过T4SS运输的难题；接下来利用Split-GFP方法测定了Cag PAI上编码的其他潜在效应蛋白HP0535和HP0523的转运，发现其不能通过T4SS转运到受体细胞；进一步通过不断截短CagA蛋白C-端和N-端氨基酸序列的方法检测了T4SS识别和转运效应蛋白的必需氨基酸序列，发现CagA的C-端氨基酸序列是其转运的必要而不充分条件，而N-端氨基酸序列则对于CagA蛋白的正常表达有重要作用。综上研究，我们建立了利用Split-GFP研究H. pylori蛋白转运的实验方法，对其T4SS的蛋白转运机制有了更进一步的认识。.研究中，我们对于H. pylori的遗传操作进行了进一步优化，构建了基因敲除质粒载体pSJHK和pSJHC，开发了基因无痕敲除方法并优化了质粒转化的实验条件。此外，我们还发现了一个新的影响H. pylori致病作用的基因位点hp0788。该基因编码一个外膜蛋白HofF，其敲除能够影响H. pylori对胃上皮细胞的吸附，同时降低H. pylori感染引起的宿主细胞凋亡。这说明基因hp0788参与H. pylori感染致细胞病变的过程。该基因功能的阐明有助于深入了解H. pylori与宿主细胞的相互作用机制，并为H. pylori的防治提供潜在的靶位点。