基于体内感染模型的CMV潜伏感染中关键miRNA的鉴定、功能及其作用机制研究

Cytomegalovirus (CMV) is known as a high prevalence among population. Due to its lifelong latent infection, successful attempts to control CMV spread require understanding and blocking of its latent infection. Considering that in vivo MCMV miRNA expression profiles are quite different from those detected in vitro, as well as few animal models for HCMV, we investigate the effect of MCMV miRNAs related to latent infection based on animal models. We found that over-expression of several miRNAs inhibited the MCMV reactivation, leading to maintenance of MCMV latency. Therefore, the purpose of this study is to establish a △mi-MCMV with loss expression of miRNA based on Crispr-Cas9 technology, and investigate the infection on several animal models, which can contribute to identification of MCMV miRNAs related to latent infection. After analysis and verification of miRNA targets, we plan to compare the targets of HCMV miRNAs with those of MCMV miRNAs based on homology analysis, which will be beneficial to understanding of CMV latent infection.

巨细胞病毒（CMV）在人群中感染率极高，感染后CMV在宿主体内建立终生潜伏，阻断CMV的潜伏感染是防治其传播的根本手段。由于体内和体外感染中CMV的miRNA表达有差异性，同时人巨细胞病毒（HCMV）尚无合适的动物模型，我们在前期研究中利用小鼠巨细胞病毒（MCMV）构建了病毒的原发、潜伏、活化期模型，并对其中潜伏相关miRNA进行筛选。我们发现了部分病毒miRNA的过表达可显著抑制MCMV在小鼠体内的活化，促进MCMV持续潜伏。在此基础上，本课题拟利用Crispr-Cas9技术分别敲除MCMV表达miRNA部位的基因，并利用已构建的多种MCMV感染动物模型观察敲除后病毒感染状态的变化，从而在体内环境下筛选潜伏维持关键miRNA；在分析及验证其靶标结合位点后，进而通过同源性分析探讨人巨细胞病毒（HCMV）潜伏相关miRNA的作用机制，为阻断CMV潜伏感染提供理论依据。

巨细胞病毒（CMV）在人群中感染率极高，感染后CMV在宿主体内建立终生潜伏，阻断CMV的潜伏感染是防治其传播的根本手段。由于体内和体外感染中CMV的miRNA表达有差异性，同时人巨细胞病毒（HCMV）尚无合适的动物模型，我们在前期研究中利用小鼠巨细胞病毒（MCMV）构建了病毒的原发、潜伏、活化期模型，并对其中潜伏相关miRNA进行筛选。我们发现了部分病毒miRNA的过表达可显著抑制MCMV在小鼠体内的活化。. 基于生物信息学研究，以MCMV miRNA和HCMV miRNA的相似性进行线索，系统分析了其中的共同点，我们发现HCMV miRNA可能靶向人的IFN及其下游的JAK-STAT信号通路作为CMV实现其免疫逃逸和终生潜伏的机制之一。通过一系列的筛选手段，我们发现了一个新的miRNA：US33as-5p，它的靶点可能是干扰素的受体1（Interferon Receptor 1，IFNAR1）。在前期功能研究中，我们依赖对MCMV miRNA的分析经验，系统的对HCMV US33as-5p的表达时间、过表达和沉默表达后宿主细胞的变化进行了探索。. 虽然在前期研究中我们发现了HCMV US33as-5p的功能线索，但这依然不能确定HCMV US33as-5p的确切功能。因为HCMV的表达是缓慢而长期的，在细胞感染状态，我们无法长期、稳定的对HCMV miRNA进行持续的干预。此外，我们也担心HCMV US33as-5p的功能是否被我们过分的夸大，因为转染miRNA mimics的方法可能和正常病毒感染时期编码miRNA的表达量相差甚远。为此，我们迫切的希望对HCMV US33as-5p的编码序列进行精准敲除，构建ΔmiRNA HCMV缺失株。我们随后通过Crispr-Cas9技术对HCMV的miRNA序列进行了精准编辑。. 凭借我们构建的ΔmiRNA HCMV病毒株，我们成功的在HCMV急性感染、潜伏感染和活化感染时期持续的对US33as-5p的功能进行了追踪。具体包括在不同时期，通过给与或不给与IFN刺激，观察宿主细胞在感染WT HCMV株和感染ΔmiRNA HCMV后表达IFNAR1的变化，以及下游Jak-STAT信号通路的影响。这一结果可有助于加深对HCMV如何实现免疫逃逸的机制的理解，并可后续针对此途径开展有针对性的干预手段。