胰岛β细胞内晚期糖基化终末产物受体（RAGE）胞内段相互作用蛋白的鉴定及功能分析

Absolute and relative insufficient insulin secretion plays a pivital role in both type 1 and type 2 diabetes. Cytokines, and glucolipotoxity are involved in depressing insulin secretion, insulin synthesis, even worse, leading to pancreatic β-cell apoptosis. Our resent studies demonstrated that advanced glycation end products (AGEs) caused more damage than that of cytokines and glucolipotoxity. Further study revealed that AGEs-RAGE interation was contributed to β-cell apoptosis through mitochondria mediated endogenous signal pathway. In addition, AGEs were able to repress insulin synthesis and secretion. However, the mechanism of how to conduct extracellular signal via membrane receptor, receptor of AGEs (RAGE) to induce β-cell dysfunction and apoptosis treated with AGEs is still indistinct. Thereby, it is very important to search and identify the interaction protein of cytoplasmic domain of RAGE. The objective of our present study is to find the RAGE-interaction proteins using affinity chromatography, yeast two-hybrid, and co-IP assays, and to elucidate one or more RAGE interaction proteins related to AGEs inducing impairment in pancreatic β-cells.

在1、2型糖尿病的发病机制中，胰岛素绝对或者相对不足导致胰岛素分泌障碍起着举足轻重的作用，炎症介质和糖脂毒性都可导致胰岛素分泌和合成的减少,甚至β细胞的凋亡。值得注意的是，我们最近的实验结果提示，晚期糖基化终产物(AGEs)具有比上述物质更强的诱导β细胞凋亡的作用。进一步研究发现，AGEs可以通过与其受体（RAGE）结合诱导内源性途径的胰岛β细胞凋亡，并且对胰岛素基因的合成及胰岛的GSIS功能都有明显的抑制作用。但是，膜受体RAGE如何传递胞外信号介导β细胞凋亡及功能损伤的机制，目前仍不清楚。因此，寻找并鉴定RAGE胞内段的相互作用蛋白显得特别重要。本研究的目的，就是借助于亲和层析纯化、酵母双杂交和co-IP等方法，找到与RAGE相互作用的蛋白，明确AGEs通过RAGE及其胞内段相互作用蛋白对胰岛β细胞的损伤机制。

晚期糖基化终产物（Advanced Glycation End Products，AGEs）是由续增高的血糖与血浆中的蛋白质、脂类等生物大分子发生非酶促糖基化反应产生的一类毒性物质，在糖尿病并发症以及胰岛β细胞功能损伤和细胞凋亡中发挥重要作用。目前研究认为，AGEs的毒性作用是通过其受体RAGE所介导的。RAGE作为单次跨膜域的膜受体，可以在其配体的刺激下激活细胞内的信号转导，如PI3K/AKT、p21ras/ERK1/2 MAPK或者NADPH氧化酶/ROS等，诱导细胞发生凋亡、迁移和增殖等病理性损伤。AGEs/RAGE轴的信号转导依赖于其胞内段结合蛋白执行的，目前已知的RAGE胞内段结合蛋白有ERK和Dia1，远不能解释RAGE所介导的复杂生物学事件。我们的研究目的就是通过GST-pull down联合质谱技术，高通量筛选出RAGE胞内段结合蛋白，发现这个或者这些蛋白在AGEs介导的胰岛β细胞功能损伤和凋亡中的作用，为揭示RAGE复杂的信号网络提供线索。在本课题的资助下，我们初步得到十种与RAGE胞内段结合的蛋白：Tagln、Abgd12B、Trim3、Cep57、Vps54、Casp1、Mcf2L、Ppil5、Ptbp1、Rab31和Cask；进一步研究发现Rab31可能参与了AGEs/RAGE介导的胰岛β细胞凋亡。通过co-IP和免疫荧光染色实验，我们发现RAGE和Rab31在AGEs诱导下发生相互作用；通过过表达和RNA干扰技术结合活细胞工作站观察，发现Rab31可以介导RAGE在AGEs诱导后的内吞作用：过表达Rab31可以促进RAGE的内吞；反之，干扰Rab31抑制了RAGE的内吞；干扰Rab31减弱了AGEs的信号向胞内传导，加重AGEs对β细胞的凋亡诱导作用，说明RAGE的内吞减弱了AGEs信号传导。本研究表明，Rab31在AGEs诱导的RAGE膜定位增加和信号活化过程中起着至关重要的作用，维持膜上高水平的RAGE表达是AGEs诱导β细胞凋亡的分子基础。本项研究不但为AGEs/RAGE信号轴诱导β细胞凋亡提供理论基础，而且还为糖尿病的防治提供潜在的靶点。