囊素三肽鸡B淋巴细胞相互作用蛋白的筛选及功能分析

囊素三肽（bursin，BS）是法氏囊组织中重要的生物活性因子，不仅能诱导禽类B淋巴细胞发育分化，而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。目前，有关BS对B淋巴细胞作用的确切机制尚不清楚。本项目以BS促B淋巴细胞抗体合成的调控机制为切入点，拟采用T7噬菌体展示技术筛选B淋巴细胞BS相互作用蛋白基础上，运用RNAi技术，抑制B淋巴细胞中BS作用蛋白的表达，研究BS作用蛋白对BS诱导B淋巴细胞重要信号分子基因表达水平、B淋巴细胞sIgM mRNA的表达水平、胞内第二信使cAMP和cGMP的水平、细胞信号通路激酶活性水平的影响，在此基础上深入探讨BS作用蛋白在BS促B淋巴细胞信号转导中的作用。本项目的研究，可从分子水平为BS与B淋巴细胞相互作用提供实验证据。对于揭示BS促B淋巴细胞抗体合成的调控机制，深入研究BS在体液免疫中的作用机理具有突破性的意义。

囊素三肽（bursin，BS）是法氏囊组织中重要的生物活性因子，不仅能诱导禽类B淋巴细胞发育分化，而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。目前，有关BS对B淋巴细胞作用的确切机制尚不清楚。本项目以BS促B淋巴细胞抗体合成的调控机制为切入点，利用T7噬菌体展示技术成功构建了鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA文库，构建的鸡DT40细胞T7噬菌体cDNA原始文库的滴度为1.2×104 pfu/mL，重组子占91.7%，扩增后文库的滴度为1.9×109 pfu/mL。对文库经过四轮筛选获得4条BS相互作用蛋白，分别为Ppp2r5c、CD86、Gabrb3和Kif18b。BS刺激的鸡DT40细胞的基因表达谱分析结果显示，BS刺激的鸡DT40细胞共有1008个差异表达基因，其中上调表达差异基因数为560，下调表达差异基因数为448， GO数据库注释的有727个差异基因，而Biological Process有211个差异基因，主要参与TGF-β受体信号通路正调控、自然杀伤细胞的分化、前体B细胞的分化、细胞发育的正调控、细胞因子IL-1的调控、B细胞分化的负调控等生物过程。利用KEGG数据库对差异基因进行Pathway分析，结果发现，BS刺激组差异基因调节的21个通路中多条通路与其免疫调节功能有关。其中Intestinal immune network for IgA production通路中涉及的差异基因为CD86和BLB1。本研究结果提示BS可能依赖CD86途径发挥免疫调节功能。CD86是表达在抗原提呈细胞表面的共同刺激性配体，是免疫超家族成员之一，在调节机体的免疫应答中具有重要作用。本项目组进一步运用RNAi技术，抑制DT40细胞中BS作用蛋白CD86分子的表达发现，siRNA下调鸡CD86基因表达水平后可显著降低BS促鸡DT40细胞sIgM的表达量。结果表明，BS促DT40细胞sIgM表达依赖于CD86分子途径。本项目的研究，已从分子和细胞水平为BS与B淋巴细胞相互作用提供实验证据。实验成果对于进一步深入揭示BS促B淋巴细胞抗体合成的调控机制和深入研究BS在体液免疫中的作用机理具有突破性的意义。