Neuritin与HSP60在肝损伤再生修复中的相互关系及对细胞增殖/凋亡调节作用机制研究

Neuritin, once regarded as a neurotrophic factor only impact nerve system, recent studies showed that Neuritin also has effects on non-neural cells, but the mechanism through which remains unknown. Our research demonstrated that Neuritin interacts with HSP60, suggested that Neuritin may has inner connection with HSP60 in function, and may co-regulate the cell development with HSP60. The synthesis of HSP60 increases with the stimulation of physiological stress or under a pathological state, thus impact the growth and development of cells more directly. We presumed that Neuritin may act as an upstream factor to promote the growth of cells through the interaction with HSP60. In this study, co-immunoprecipitation technology was used to verify the interaction of Neuritin and HSP60; Gene expression and RNA interference technology were used to observe the effect of HSP60 levels and growth of cells when Neuritin was over or lowly expressed, thus make clear of the relationship between Neuritin and HSP60, and discuss the possible mechanism Neuritin may involved, so that to lay foundation for research on the molecular mechanism of cell regeneration and plasticity.

Neuritin，曾被认为只作用于神经的营养因子，现研究表明在非神经细胞中也有作用，确切作用机制尚不清楚。本课题组研究发现：Neuritin与HSP60有相互作用，提示：Neuritin与HSP60可能存在功能上的内在联系，两者共同参与细胞的生长发育调节过程，且HSP60是与生理应激或病理状态下在细胞内合成显著增加，相对更直接地影响细胞的生长发育。我们推测：Neuritin的作用机制之一是作为上游因子，通过与HSP60的相互作用，促进细胞生长发育。故本研究首先利用免疫共沉淀技术进一步验证Neuritin与HSP60的相互作用；再利用基因表达技术和RNA干扰技术，分别观察Neuritin过表达和表达降低对细胞中HSP60水平以及细胞生长发育的影响，旨在进一步明确Neuritin与HSP60的关系，探讨Neuritin可能的作用机制，为深入研究细胞再生与可塑性的分子机制奠定理论基础。

本课题组在前期研究发现：Neuritin与HSP60有相互作用，本课题组通过对损伤肝组织进行免疫组化病理分析以及蛋白分子方面研究，证实了Neuritin与HSP60的确能影响细胞的生长发育，1.病理检测：血液ALT、AST 升高被认为是判断急性肝损伤严重程度的经典指标，本实验中，ALT、AST在肝损伤后6、12、24、48 h 的表达量增加，而HSP60 在肝损伤后6、12、24、48 h 的表达与其基本一致，呈逐渐升高，并在48 h 时表达最高，而Neuritin在肝损伤后6、12、24、48 h 的表达量逐渐降低，并在48 h 时达到最低，在损伤后3、7、14 d 其表达量逐渐升高；，2.蛋白分子水平研究：Western blot结果（1）Neuritin在肝细胞内的低表达（和过表达），凋亡因子Caspase-3渐渐增高（和减低）。Neuritin相对表达量变化趋势与Caspase-3相对表达量变化趋势之间存在明显负相关性（r = -0.993，P < 0.05）。（2）Hsp60在肝细胞中的低表达（和过表达），凋亡因子Caspase-3相对表达量渐渐增高（和减低）。HSP60相对表达量变化趋势与Caspase-3相对表达量变化趋势之间同样存在明显负相关性（r = -0.996，P < 0.05）。（3）Neuritin和HSP60在细胞免疫荧光中Merge后定位均在细胞膜。（4）利用Transwell细胞迁移和细胞划痕愈合实验观察Neuritin和HSP60对细胞迁移的影响；⑴加入不同浓度的Neuritin，在10ng细胞增殖最为明显，而加入同样浓度的Neuritin，细胞增殖无统计学意义；⑵在不同时间段加入不同浓度的HSP60细胞增殖均有增加，超过安全浓度细胞增殖减弱。