巨大芽孢杆菌NCT-2对次生盐渍化土壤中硝酸盐同化机制研究

土壤次生盐渍化严重影响作物生长，而硝酸盐是次生盐渍化土壤中主要盐分。提高微生物对硝酸盐的同化效率，对促进植物生长、减少亚硝酸盐及温室气体氧化亚氮排放，具有重要意义。我们从次生盐渍化土壤中筛选到一株兼具耐盐和硝态氮同化能力的巨大芽孢杆菌- - NCT-2。本项目以其为对象：①研究盐胁迫对该菌株硝态氮同化能力及硝酸盐同化过程中的三个重要酶，即硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响；②根据同源序列设计引物，从NCT-2菌株中分别克隆这三个酶的基因片段，通过染色体步移法获得全长基因；③利用同源重组的方法，通过基因敲除和基因回复研究这三个酶的相关基因在硝态氮同化中的作用；④设计引物进行荧光定量PCR检测，研究盐胁迫及硝酸盐、亚硝酸盐和铵盐诱导下这些相关基因的表达模式，以期阐明盐协迫下NCT-2的硝态氮同化机制，为开发生物菌肥、治理次生盐渍化、提高土壤肥力及作物的氮素利用率，提供科学依据。

从有十多年栽培历史的设施大棚土壤中，分离到一株能高效同化土壤硝酸盐的细菌，命名为NCT-2。经形态特征观察、生理生化鉴定、Biolog分析和16S rDNA分子鉴定，菌株NCT-2鉴定为巨大芽孢杆菌(Baclillus megaterium)。在无机盐培养基中，该菌株同化硝酸盐的最适pH值为7.0，最适温度为30℃。菌株在pH 5.0的培养基上仍具有较高同化硝酸盐的能力。在硝态氮浓度为300mg/L时，NCT-2菌株在48h内可完全同化硝酸盐。NCT-2菌株在生长和同化硝酸盐过程中可以耐受3%的盐度；菌株同化硝酸盐不受金属离子Pb2+和Zn2+的影响，而且Fe3+可以提高NCT-2同化硝酸盐的能力。. 通过文库构建和Solexa测序，获得NCT-2菌株的基因组草图，并将序列提交至NCBI数据库，登录号为AHTF00000000。对NCT-2菌株中硝酸盐同化过程的3个关键酶（硝酸盐还原酶电子转移亚基NasB 和催化亚基NasC、亚硝酸盐还原酶大亚基NasD和小亚基NasE、和谷氨酰胺合成酶GlnA）进行了基因克隆。通过荧光定量PCR分析NCT-2菌株在不同浓度硝酸盐培养中，nasC、nasD和glnA表达量变化。研究结果表明，硝酸盐能诱导nasC表达，且随着硝酸盐浓度的增加，nasC、nasD和glnA的转录表达量增加。同时测定这三种硝酸盐同化酶的酶活性，结果表明，三种酶的活性变化与基因表达呈现相似的趋势。表明巨大芽孢杆菌NCT-2中存在硝酸盐同化通路。以上研究结果，为深入探索巨大芽孢杆菌NCT-2对硝酸盐的同化作用机理奠定了基础。.将NCT-2菌剂施用在蔬菜大棚的土壤中，发现NCT-2菌剂降低了土壤EC值和硝态氮含量，增加了土壤有机质含量及土壤微生物数量。在硝态氮含量为262 mg/kg土壤中，施入菌剂后，与对照相比，土壤EC值下降了31.0%，硝态氮降低了24.6%，有机质提高了29.7 %。Biolog分析表明，菌剂可有效提高土壤微生物对碳源的利用能力，增加了利用不同碳源的微生物数量，从而提高土壤微生物活性和群落丰富度。DGGE分析表明，NCT-2菌剂能显著提高大棚硝酸盐型次生盐渍化土壤中的微生物多样性。这些结果表明，巨大芽孢杆菌NCT-2菌剂能降低硝酸盐过量的负面效应，促进其它微生物的生长，提高土壤微生物多样性，有助于提高次生盐渍化大棚土壤肥力的恢复。