RDH和Raldh2在心肌发育和细胞分化中的作用研究

本课题以视黄酸代谢中的关键基因，RDH和Raldh2作为研究对象，通过建立基因敲除斑马鱼动物模型，并以P19细胞为研究对象，构建基因表达载体和沉默表达载体。开展以下研究：1.首先获得斑马鱼RDH基因在斑马鱼心脏发育不同阶段的时空表达规律2.建立基因敲除斑马鱼动物模型，观察RDH 和Raldh2基因功能下调，对斑马鱼心脏发育及心肌细胞分化的影响2.构建RDH和Raldh2的表达载体和沉默表达载体，探讨基因过表达和缺乏对心肌细胞发育的影响及对心肌发育相关基因表达的影响。通过以上研究,获得斑马鱼RDH和Raldh2影响斑马鱼心脏发育的形态学和分子生物学证据，初步明确RDH和Raldh2在心肌发育和细胞分化中的作用及其机制，及与心肌发育相关基因的关系。

本课题采用斑马鱼和P19细胞进行体外实验，对以视黄酸代谢中的关键基因，RDH和Raldh2在脊椎动物-斑马鱼心脏发育中的机制进行研究，建立了斑马鱼Raldh2和RDH基因敲除动物模型，并以P19细胞为研究对象，构建基因表达载体和沉默表达载体。开展了以下研究并获得了如下实验结果：1.RDH基因功能下调斑马鱼表现出斑马鱼心脏、鳃弓和神经嵴细胞的发育缺陷，并且表现出心脏功能障碍，RDH基因下调斑马鱼表型具有视黄酸缺乏动物模型的典型特征，证实RDH与Raldh2同样是视黄酸合成中的关键酶。 2.Raldh2基因下调斑马鱼表现出与RDH基因功能下调斑马鱼相似的动物表型，只是表型更为严重。说明Raldh2的作用，不像RDH，功能上有其他成员可以对其功能进行代偿。3.构建RDH和Raldh2的表达载体和沉默表达载体，Raldh2下调会改变基因表达模式。实时定量PCR和western结果均显示，与对照组细胞相比，Raldh2基因下调P19细胞心肌分化特异性的分子标记物表达水平下降。Raldh2基因下调导致Gata4、Mef2c、a-MHC 和CTnT 的表达水平下调，同时心脏前体特异基因-Nkx2.5的表达却明显上调。Rdh10干扰会改变P19细胞向心肌细胞诱导过程中的基因表达模式，心肌细胞特异性的分子标记物Ctnt表达水平明显下调，而心肌前体特异性转录因子Nkx2.5的表达明显升高，Rdh10干扰载体转染P19心肌细胞特异性转录因子的表达变化模式细胞与Raldh2干扰载体转染P19细胞相似。说明Rdh10基因下调可以导致视黄酸缺乏的特征。.视黄酸信号通过调节心肌发育相关基因的表达，从而对心肌前体的分化和发育过程起着重要的调节作用。通过以上研究，我们获得了RDH和Raldh2影响斑马鱼心脏发育的形态学和分子生物学证据，初步明确RDH和Raldh2在心肌发育中的作用及与心肌发育相关基因的关系，并了解了RDH和Raldh2在功能上的异同点。