鸡大肠杆菌iss基因在免疫防制中的作用

In order to determine the immune potential of iss gene, the virulence of avian E.coli isolates will be detected, and each isolate will be examined for the presence of iss gene by using PCR techniques.Antiserum against Iss fusion and normal serum will be both generated. The possession of Iss protein will be detected by indirect ELISA, and survival of avian E.coli isolates in normal serum will be linked with the survival of them in antiserum to analyze the immune effect of antibody on avian E.coli serum-resistance in vitro. And it will be detected that chickens immuned with Iss fusion will, or will not be protected against challenge by avian pathogenic E.coli in vivo. Influence of iss sequence on virulence of avian E.coli and immune potential of Iss protein will be determined.

尽管鸡大肠杆菌的致病力是多因素控制的，但通过肺泡毛细血管进入血循环是其发挥致病作用的关键一步。iss基因为血清抗性基因，与致病力相关，体外试验证实一株鸡致病性大肠杆菌HO2菌株的Iss融合蛋白抗血清可以降低HO2菌株在血清中的存活率。但iss基因序列差异位点与拷贝数对细菌致病力的影响以及对Iss蛋白免疫防制效果的影响仍然不明。因此拟采集数十株鸡大肠杆菌菌株，进行致病力试验、血清抗性试验、iss基因套式PCR、实时荧光定量PCR、测序及Iss蛋白间接ELISA检测，确定iss基因序列差异位点与拷贝数对Iss蛋白的表达水平、血清抗性及菌株致病力的影响；依据iss基因序列差异设计若干原核表达系统，分别分离Iss蛋白并免疫鸡只获得相应抗体，通过体外试验和动物试验分析抗Iss蛋白抗体对试验动物是否具有保护作用或交叉保护作用。为探讨iss基因对细菌致病力的影响及对Iss蛋白免疫防制效果的影响提供依据。

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的细菌性传染病。iss基因（increased serum resistance gene）被认为是致病因子之一，与菌株血清抗性有关。但iss基因的存在、序列差异位点、转录水平（mRNA拷贝数）等因素对菌株致病力及血清抗性的影响还不清楚；Iss融合蛋白亚单位疫苗是否具有交叉免疫保护作用、广泛的免疫保护范围，也缺乏分析和阐述。试验采用PCR、套式PCR以及实时荧光定量PCR等方法，对91株鸡大肠杆菌iss基因进行扩增、测序，并通过雏鸡致死试验、鸡胚致死试验、血清抗性试验等，分析iss基因的存在、序列差异位点、iss基因转录水平等因素与大肠杆菌致病力及血清抗性之间的关系；通过体外试验与动物体内试验分析Iss融合蛋白的交叉免疫保护作用及免疫保护范围。结果显示，iss基因在鸡大肠杆菌中可能是广泛存在的，但其拷贝数及核苷酸序列有明显差异。差异位点中，第135位差异位点与致病力及血清抗性均呈极显著相关（p＜0.01）。菌株致病力及血清抗性的主要影响因素是iss基因序列差异位点及转录水平（mRNA拷贝数）（p＜0.05），而不是基因的存在。GST-Iss融合蛋白亚单位疫苗，在体外试验中抑制了部分菌株的血清抗性，且在不同血清型菌株间、不同iss核苷酸序列菌株间表现出交叉抑制作用。机理为：抗血清可在细菌增殖分裂期间通过抑制iss基因的转录，降低细菌血清抗性。但各菌株对Iss抗血清的敏感性具有明显差异，此差异与iss基因初始转录水平、基因序列均无相关性(p > 0.05)，且动物体内试验保护作用不明显。因此，单一应用Iss蛋白作为亚单位疫苗，其应用潜力是有限的，探讨多基因联合的亚单位疫苗可能具有更好的实际意义。这为鸡大肠杆菌病的防制及亚单位疫苗的研制提供理论依据及借鉴。