ROBO2基因在鸡新城疫抗病育种中的作用及其分子机制

Newcastle disease is one of the most extensive and contagious bird diseases, and belongs to the first infectious disease in animals. To date, studies on epidemiology and etiology of Newcastle disease have been highly paid attention; however, the molecular genetics studies on host-specific immune are limited. Recently, we found the closely relationship between the variation in the ROBO2 gene on chromosome 1 and the antibody level to Newcastle disease virus in chicken by a genome-wide association study and gene expression analysis. Following the previous results, we are going to analyze the relationship between ROBO2 gene and receptors of Newcastle disease virus and to measure the changes on physiology and biochemistry involving in cell migration, maturation and differentiation, immune genes expression and interaction for the embryo fibroblasts, dendritic cells and lymphocytes with the different genotypes of the ROBO2 gene post ROBO2 knockdown by siRNA and post immunization Newcastle disease virus. Other together with bioinformatics and the results of the previous spleen transcriptomes, we will infer the molecular mechanism how the ROBO2 gene impacts on the immune response to Newcastle disease virus in chicken, which will provide theories and technical support for controlling Newcastle disease and the chicken breeding for resistance to Newcastle disease.

新城疫作为我国的“一类动物疫病”，是养鸡业的头号烈性传染病之一。目前研究者主要关注其病原和流行病学的特点，而对于宿主特异性免疫的分子基础研究匮乏。我们新近通过全基因组关联分析和基因表达技术确定了鸡ROBO2基因与新城疫病毒抗体水平密切相关。以此为基础，本课题拟分析ROBO2基因与鸡新城疫病毒受体的关系；分离培养或转化ROBO2基因不同基因型的鸡胚成纤维细胞、树突状细胞和淋巴细胞等免疫相关细胞，并培养用siRNA沉默ROBO2基因后的鸡胚成纤维细胞、树突状细胞和淋巴细胞；探讨所有培养的ROBO2基因不同变异类型（包括基因沉默）细胞在接种新城疫病毒后的细胞迁移、细胞成熟和分化、经典免疫通路因子表达等生理生化变化以及细胞间的相互作用，结合生物信息学知识和前期脾脏转录组分析结果提出一个关于鸡ROBO2基因变异如何影响新城疫病毒免疫应答的分子机制，为鸡新城疫的防控以及抗病育种提供理论基础和技术支持。

ROBO2基因功能的深入研究对于从育种角度实施新城疫的防控具有重要意义。本项目首先通过eQTL策略找到多个与ROBO2相关的免疫基因，进一步确认了ROBO2基因与鸡的免疫应答具有密切关系。其次，利用免疫荧光技术发现ROBO2蛋白与部分新城疫病毒共定位，利用病毒铺敷蛋白印迹技术鉴定出ROBO2蛋白与鸡新城疫病毒蛋白可以结合，且不同ROBO2基因变异对新城疫病毒侵入细胞的数量不同，细胞内ROBO2基因表达和新城疫病毒的含量同步发生变化，表明ROBO2基因可以是鸡新城疫病毒受体或结合蛋白，但ROBO2可能是新城疫病毒的抑制基因。另外，成功培养转化ROBO2基因上rs15354805位点不同基因型鸡树突状细胞并获得RNAi沉默ROBO2基因的鸡树突状细胞、鸡胚成纤维细胞和淋巴细胞；新城疫病毒接毒后细胞内ROBO2基因表达量下降，rs15354805位点不同基因型树突状细胞的的敏感性不同，其中ROBO2基因的表达GG型高于AA型，而IL6和INF-γ基因的表达则相反，影响鸡树突状细胞成熟的CCR6和CCR7基因的表达量GG型个体分别下降和上升更多，表明ROBO2基因的表达间接影响鸡树突状细胞成熟；而GG基因型树突状细胞中影响白细胞趋化的XCR1基因的表达要高于AA基因型树突状细胞，同时随接毒时间变长而出现近细胞膜上点状聚集出现细胞单极化，表明ROBO2基因可以影响新城疫病毒成熟的树突状细胞迁移；结合前期全基因组关联分析和脾脏转录组试验结果，综上可知ROBO2蛋白通过与新城疫病毒的结合与抑制作用，间接影响树突状细胞的成熟与迁移，从而调节树突状细胞与淋巴细胞相互作用导致不同基因型个体对新城疫病毒的免疫应答存在差异。上述研究结果为新城疫抗病育种的实施提供了新思路。已累计发表论文5篇，获授权发明专利2件，获中华农业科技奖1项，实现转化收益361万元，入选省级以上人才计划2人，培养研究生3名。