基于白介素-1信号通路和Wnt/β-连环蛋白信号通路的黄原胶抑制骨关节炎软骨降解作用机制的研究

Xanthan gum (XG) is a natural microbial extracellular heteropolysaccharide. Our previous studies demonstrated that Intra-articular (IA) injection of XG (5 200 kDa-5 400 kDa) could protect the articular cartilage in experimental animal OA models, relieve inflammation and alleviate pain. Furthermore, XG reversed significantly IL-1β-induced chondrocyte injury. But the action mechanism is not clear. The IL-1 signal pathway and Wnt/β-catenin signal pathway are two of the important signal pathways in the course of OA. XG inhibits probably cartilage degradation through blocking the two signaling pathway targets. In this study, the experimental OA model in vivo is established by anterior cruciate ligament transectomy and the experimental OA models in vitro are established by IL-1β-induced and Wnt 3a-induced rabbit chondrocyte injury. After intervening with XG injection, the protein and mRNA levels of related factors will be detected and the action mechanism of XG inhibiting cartilage degradation will be investigated through the effects of XG on IL-1 signal pathway and Wnt/β-catenin signal pathway in vivo and in vitro and the relationship of the two signal pathway in OA.

黄原胶（XG)是经发酵生产的一种微生物胞外杂多糖。申请者前期发现，关节腔内注射相对分子质量（Mr）为520-540万的XG可保护软骨，抑制实验性骨关节炎(OA)进程并减轻炎症、缓解疼痛；而且XG也可保护体外培养的兔软骨细胞，减轻白介素1β（IL-1β）对其损伤。但作用机制还有待进一步探讨。IL-1通路和Wnt/β-连环蛋白通路为OA病程中2条重要信号通路。为此，我们提出假说，XG可能通过抑制以上2条通路的特殊靶点抑制OA软骨降解。为验证这一假说，我们用前交叉韧带切断术建立实验性OA体内模型；用重组IL-1β和Wnt3a建立实验性OA体外模型。经XG干预后，通过检测MARKs、NF-κB、β-catenin等相关蛋白和mRNA的表达，研究XG对以上2条通路的影响，并报道该2条通路在OA中的相互作用，进而揭示XG抑制OA软骨降解的作用机制，为开发治疗OA新药提供理论支持。

本课题通过体内实验采用前交叉韧带切断术（ACLT）建立体内骨关节炎（OA）模型，并给XG和玻璃酸钠（SH）干预，记录家兔体温度、膝关节腔温度和膝关节宽度；术后第9周处死，对股骨髁和胫骨平台软骨做大体形态学及组织学观察及评分，与SH组相比较，评价XG对ACLT诱导的OA软骨的保护作用；用Western-blot测定关节软骨中，细胞凋亡蛋白酶3（caspase-3）、细胞凋亡相关因子Bax和凋亡抑制因子Bcl-2等蛋白的表达；初步探讨XG抑制ACLT诱导的兔OA模型软骨凋亡的机制。体外实验通过培养兔膝关节软骨细胞，分离培养并鉴定，采用（0.0625~2 mmol/L）硝普钠（SNP）诱导软骨细胞凋亡，分别于12、24、48 h采用四甲基偶氮唑盐比色试验法MTT和末端脱氧核苷酸转移的dUTP缺口末端标记法评价并比较不同浓度SNP诱导软骨细胞凋亡模型。在确定体外模型制备的参数后，首先经XG和SH预处理，再经SNP诱导24 h，采用MTT，流式，扫描电镜，罗丹明123染色和ELISA等方法检测细胞增殖，凋亡率，受损形态，以及线粒体膜电位的改变和前列腺素E2的含量；与SH组相比较评价XG对SNP诱导的OA软骨细胞凋亡的保护作用；对Caspase-3，Bax和Bcl-2等相关因子的蛋白表达进行检测，探讨XG抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡的机制。此外通过大鼠实验对黄原胶药代动力学进行研究。结果表明：（1）兔膝关节腔内注射XG（1%）和XG（2%）可保护OA中的软骨，抑制软骨细胞凋亡，缓解疼痛；（2）SNP浓度为0.3～2 mmol/L且诱导12、24和48 h可制备不同严重程度的软骨细胞凋亡模型，成功率高，稳定且可重复；（3）XG可对体外SNP诱导OA中软骨细胞具有保护作用，可通过调控Capsase-3，Bax和Bcl-2来抑制软骨细胞凋亡保护软骨进而缓解OA进程。（4）通过本研究可确定XG经大鼠关节腔给药后，可发生排泄，主要途径为体内代谢为CO2经呼吸排泄，少量经尿液排出，几乎不通过粪便排泄。