基于FRET技术的GABA对视网膜水平细胞侧抑制调控机制的研究

Recent studies have reported that disorders in receptive field function can cause visual perception problems in early stages of retinal degenerative disease, which may be related to lateral inhibition in horizontal cells. But the mechanisms regulated lateral inhibition are not fully understood. pH-sensitive mechanism and γ-aminobutyric acid (GABA)-regulated mechanism are the main hypotheses. Our previous work suggested that a GABA and pH-sensitive mechanism co-regulates the feedback inhibition from horizontal cells to photoreceptors. However, direct evidences to prove GABA participation are still insufficient, which is mainly because the lack of live cell labeling and detection techniques for GABA. Recent reports showed that fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors can detect the spatial-temporal distribution of neurotransmitters. In our previous work, we have used FRET to perform several projects. In the proposed study, detection of GABA in both single cells and retinal slices are investigated using FRET. Modification of GABA-binding FRET probe, detection of extracellular GABA concentration in single cells and study of GABA release and lateral inhibition mechanisms in slices are included. The results will reveal the contribution of GABA to lateral inhibition in retinal horizontal cells, and provide biological support for treatment of retinal degenerative disease.

有研究表明，水平细胞侧抑制功能与视网膜变性疾病早期感受野功能紊乱导致的错误视觉感知密切相关。但目前对水平细胞侧抑制的调控机制了解仍不充分，存在pH敏感机制、GABA调控机制等假说。申请人前期对水平细胞侧抑制的研究提示GABA和pH共同参与了对光感受器负反馈的调节，但GABA参与侧抑制调控的直接证据不足，主要原因在于仍缺乏活体组织荧光标记手段。最近有报道显示使用荧光共振能量转移技术（FRET）可以实时检测神经递质的时空变化特征，而本课题组前期已进行了多项基于FRET技术的研究。在此基础上，本课题计划使用FRET技术，从单细胞及视网膜活性切片两个层次对GABA的分布及传递过程进行检测，内容包括改良针对GABA的FRET探针、使用FRET探针在单细胞水平检测胞外GABA含量、在切片中检测GABA的释放及调控机制。以期阐明GABA对视网膜水平细胞侧抑制的贡献，并为治疗视网膜疾病提供理论依据。

在视网膜信息处理机制研究中，对水平细胞侧抑制的调控机制仍不清楚，存在pH敏感机制、GABA调控机制等多种假说。其中GABA参与侧抑制调控的直接证据不足，主要原因在于仍缺乏活细胞荧光标记手段。本课题引入荧光共振能量转移（FRET）等技术开发荧光蛋白生物传感器，建立神经组织切片中GABA的快速实时监测方法，并进一步探索GABA对水平细胞侧抑制的贡献。.首先利用GABAB受体1亚基的胞外配体结合区（VFT）构建了针对GABA的FRET探针VFT1，由VFT区、ECFP/YPet荧光蛋白对组成。在大肠杆菌中表达纯化后获得探针蛋白。经荧光光谱验证，对GABA具有FRET现象增强的响应。用VFT1探针蛋白分别孵育脑海马切片和视网膜切片，经高钾刺激后，可记录到海马CA1区、视网膜外网状层和内网状层FRET响应增强，即GABA被释放。其中视网膜外网状层的FRET现象增强较明显，证明外网状层能够通过释放GABA参与水平细胞侧抑制的调控。以上结果表明，VFT1 FRET探针蛋白能够快速检测切片中GABA的释放，减少基因转染时间。对视网膜外网状层等对GABA作用存在争议的区域，该探针亦显示出了较好的研究应用前景。.根据分析GABAB受体获得的2亚基构象信息，设计并构建了可用于在体GABA检测的单荧光探针GBR2-GFP，由cpGFP插入2亚基胞内段构成。转染293细胞并记录探针对GABA的荧光响应，初步结果显示，施加GABA后荧光有小幅增强，但效果并不理想。后续将对cpGFP的插入位点和连接子序列进行改进。.本课题还针对研究视觉信息处理机制可能用到的电、磁刺激和动物行为学分析进行了部分应用性研究，开展了导电材料、磁性材料的制备和丰富的视觉环境对动物学习能力的改善研究，取得了一定的应用性成果。