基于病毒样颗粒技术的基孔肯雅病毒感染免疫机制研究

A Chikungunya fever epidemic outbroke in a Dongguan community in Guangdong Province in China in September 2010, which broke the scattered-input epidemic feature in China and brought challenge to disease control. Heretofore, the molecular mutational evolution of CHIKV and the feature of population infection remain to be demonstrated. Our study group conducted a preliminary analysis about the epidemic feature and found out variation in the severity of syndrome and cytokine expression, but the mechanism remained unknown. Based on the condition mentioned, our study group is planning to conduct studies about: 1) The spatial-temporal evolution characteristics of CHIKV, to investigate the origin and the variation of CHIKV; 2) The Immunological efficacy in animal model, using Pichia pastoris expression system the targeted viral C-E sequence to construct CHIKV-VLPs; 3) The molecular mechanism of infection and immunity in cellular and animal model, using infection and transcription platform based on green fluorescence modulated CHIKV-VLPs; 4) The variation of cytokine expression in different clinical stages, to analyze the relation between severity and the switch of different clinical stages and to demonstrate the immunologic mechanism of the CHIKV infection.

10 年9月广东东莞暴发国内首起社区聚集性基孔肯雅热疫情，打破我国长期以散在输入为特征的流行特点，为其防控带来挑战。迄今对该疫情CHIKV变异分子演化和致病免疫机制及群体感染特征缺乏系统研究。课题组前期从流行病学角度进行初步分析，发现感染者轻重症不同程度和阶段各细胞因子存在差异，但机制未明。基于此，本课题拟开展1）对CHIKV进行时空演化分析，探讨病毒来源与变异规律；2）以病毒C-E基因序列为目的基因，利用毕赤酵母表达体系构建基孔肯雅病毒样颗粒（CHIKV-VLPs），在动物模型上评价免疫学功效；3）利用绿色荧光修饰CHIKV-VLPs建立感染与转译示踪平台，在细胞和动物模型上探讨感染与免疫的分子机制；4）追踪感染者在急性期、恢复期不同阶段炎症因子、趋化因子和免疫相关分子的变异情况，分析轻、重症和不同阶段转归之间的关系，阐述其致病感染免疫机制。研究结果对基孔肯雅热的防控提供关键科学依据。

基孔肯雅热（Chikungunya Fever）是一种由携带基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus）的蚊虫叮咬人而引起的以持续发热和关节疼痛为主要临床特征的急性传染病。目前，在亚洲、非洲、欧洲以及美洲的 50 多个国家，已经确认有基孔肯雅热发生。在序列生物信息学里，种系分析是分子演化的重要工具，较单独的序列数据更能清晰地表现感染源的起源和散布过程，通对 GenBank 上已发布的 CHIKV 全基因组序列进行对比分析，绘制遗传进化树，找寻其暴发流行背后的遗传进化特征，为基孔肯雅热的全面预防和控制奠定基础。目前国际上并无 CHIKV 预防性的疫苗及治疗药物，病毒样颗粒疫苗是一种新形式的疫苗，根据序列分析的结果选择合适的毒株，分别使用杆状病毒表达系统及毕赤酵母表达系统构建 CHIKV 病毒样颗粒，为进行基孔肯雅疫苗进一步研究奠定基础。.主要研究结果：1. 对基孔肯雅病毒进行遗传进化分析，结果显示系统进化树上基孔肯雅病毒对应其 3 个基因型分支为 3 簇，各蛋白同源计分比值均为 0.96 以上，存在 E2 蛋白关键抗原表位的突变情况。比较 CHIKV 序列，结果显示 CHIKV 相似性较高，变异率较低，CHIKV 进化较为保守；2. 构建杆状病毒昆虫细胞表达体系，表达制备 CHIK-VLPs，SDS-PAGE、WesternBlot 和透射电镜结果证实成功表达 CHIK-VLPs；3. 构建 pGAPZαA-SMD1168 毕赤酵母表达体系，表达制备 CHIK-VLPs ，SDS-PAGE、Western Blot 和透射电镜结果证实成功表达 CHIK-VLPs；4.成功制备CHIKV nsP2目的抗原片段，纯化后纯度达80%以上可用于动物免疫实验，细胞免疫荧光检测发现，感染12h后，nsP2蛋白主要聚集于细胞核内；感染24h后，再次分布于胞浆中，呈点状或棒状。.主要研究结论：1. 比较发现CHIKV毒株进化距离呈现比较明显的时间和地区一致性。CHIKV 序列间相似性较高，变异率较低，CHIKV 进化较为保守，但在其重要功能区域出现一些位点的突变，关注其进化情况对于基孔肯雅防控工作有积极意义。2.成功制备CHIKV nsP2蛋白高免血清，可应用于该蛋白的致病机制研究。观察到CHIKV nsP2蛋白的入核现象，提示该蛋白具有入核与宿主蛋白发生相互作用的功能。