反义LNA-DNA嵌合体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖作用研究

本项目主要研究在接种PRRSV的Marc-145细胞中转染候选反义寡DNA、反义锁核酸-DNA嵌合体，对PRRSV病毒基因表达水平变化的影响；同时在本动物上验证候选反义锁核酸-DNA嵌合体的抗病毒活性。用PRRSV接种Marc-145细胞，然后转染反义DNA、反义锁核酸-DNA嵌合体，于接种后1～72小时检测病毒基因的复制和转录水平，同时进行细胞活力和病毒感染力测定；对人工感染PRRSV的猪只静脉注射反义锁核酸-DNA嵌合体，在注射后0～3天动态分析肺组织中PRRSV基因表达水平。通过体内外实验，揭示候选LNA-DNA嵌合体抗PRRSV的活性和主要作用方式，为后期发展新的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物，并最终应用于临床兽医领域奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征是世界范围内给养猪业造成巨大经济损失的重要传染病之一，特异、高效的抗病毒药物在控制PRRS中的应用必然是全面控制PRRS措施的一个良好补充。基于LNA-DNA在医学研究领域中的良好应用前景以及控制PRRS流行的紧迫性，特开展本项目。.项目以评价LNA-DNA抑制PRRSV增殖效果为研究核心，以体外细胞实验为基础，本动物感染干预治疗实验为佐证，全面评价LNA-DNA在抗PRRSV感染中的作用。通过课题研究，取得如下成果：（1）运用生物信息学方法，设计了8条针对PRRSV ORF5、NSP9、5’-UTR和ORF7基因序列的反义寡DNA，以Marc-145细胞为模型，通过细胞形态学观察，RT-qPCR 检测PRRSV基因、WB与IFA分析病毒蛋白表达水平变化等，成功筛选获得了三个在体外能显著抑制PRRSV增殖的反义寡DNA:YN4、YN5和YN8。.（2）选取作用效果最佳的反义寡DNA YN8，在参考多个研究团队实验心得的基础上，结合PRRSV的特性，对YN8进行了两端和混合间断两种不同的LNA修饰。在Marc-145细胞上就修饰后的LNA-DNA嵌合体对细胞的毒性、在细胞中的存留时间以及对PRRSV增殖的抑制能力的进行了全面评价，实验结果表明：修饰的LNA-YN8 嵌合体较未修饰前对细胞的毒性显著降低，在浓度高达48uM，仍未表现出明显的细胞毒性；在半衰期检测实验结果显示：LNA-YN8在细胞中的半衰期比未修饰的YN8延长了1倍。病毒基因表达变化、蛋白表达以及病毒毒力变化检测实验结果证实：LNA-YN8 嵌合体比YN8对PRRSV增殖的抑制能力更强，在4uM浓度时就能抑制半数以上的病毒增殖，作用效果呈剂量依赖性。.（3）仔猪感染后干预治疗实验结果也进一步证实，当以1mg/kg的剂量经静脉注射给药后3天，LNA-YN8能有效阻止病毒在肺脏组织中的繁殖，降低PRRSV感染对脏器的损伤，对控制感染的发展起到了良好的作用。本研究所取得的成果可为后续开发新的抗PRRSV药物，并最终应用于临床兽医奠定了良好基础。