重组腺相关病毒介导的游离受体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染作用研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) enters porcine monocyte/macrophage lineage by receptor-mediated endocytosis. Sialoadhesin (Sn) and CD163 are the key cellular receptors for PRRSV infection. Our previous studies showed that Sn and CD163 soluble receptors delivered by recombinant adenovirus (rAdv) have an additive antiviral effect against PRRSV in vitro and vivo. However, rAdv only keep a short expression in pigs due to its high immunogenicity. To overcome the disadvantage and investigate the inhibition mechanism of PRRSV infection by the two soluble receptors, we plan to construct a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector fusion expressing Sn and CD163 soluble receptors, and delineate the blocking effect in different steps of PRRSV infection (including attachment, internalization, replication and release, etc) by the two soluble receptors on target cells. Then inhibitory duration and dose-dependent of rAAV against different PRRSV strains will be detected. In addition, PRRSV-naïve piglets will be inoculated with rAAV to monitor the duration of the two soluble receptors by established quantitative detection method, and the inhibitory effect against PRRSV proliferation in vivo will be evaluated by antiviral experiment. These studies will provide a new idea for the prevention and control of PRRS.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通过受体介导的胞吞作用侵入猪单核-巨噬细胞系统，唾液酸黏附素（Sn）和CD163分子是参与感染的关键细胞受体。前期研究证实重组腺病毒（rAdv）介导的Sn和CD163游离受体能在体内外协同抑制PRRSV感染，然而rAdv载体的高免疫原性导致其在猪体内表达时间较短，为克服该弊端并探明两种游离受体抑制PRRSV感染机制，本项目拟构建融合表达Sn和CD163游离受体的重组腺相关病毒（rAAV），从PRRSV吸附、内化、复制和释放等环节研究两种游离受体对病毒感染靶细胞阻断作用，进而检测rAAV对不同PRRSV毒株感染的抑制时间和剂量依赖关系；另外，将rAAV接种PRRSV易感猪，利用已建立的定量检测方法监测两种游离受体在猪体内持续时间，通过抗病毒试验评价rAAV对PRRSV体内增殖的抑制作用，为PRRS的防控研究提供新的思路。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是影响养猪业健康发展的重要疫病，现有PRRS疫苗交叉保护效果不佳，且尚无特效治疗药物。PRRS病毒（PRRSV）通过受体介导的胞吞作用侵入靶细胞，CD163分子和唾液酸黏附素（Sn）是参与感染的关键细胞受体。病毒游离受体又称病毒受体陷阱，是指利用人工构建的可溶性病毒受体与细胞受体竞争性结合病毒，从而发挥类似中和抗体的作用。.前期研究证实表达CD163和Sn游离受体的2个重组腺病毒（rAdv）可在体内外协同抑制PRRSV感染，但rAdv载体的高免疫原性导致其在猪体内表达时间较短。本项目以重组腺相关病毒（rAAV）为载体，利用杆状病毒-昆虫细胞系统，制备了融合表达CD163和Sn游离受体的rAAV-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc，SRCR59-Fc和Sn4D-Fc编码序列通过P2A剪切肽串联。该rAAV体外转导猪源细胞后，能正确分泌表达2个游离受体，并能有效抑制不同PRRSV毒株感染。浓缩纯化获得游离受体蛋白后，进一步研究发现，Sn4D-Fc能够阻断PRRSV吸附靶细胞，SRCR59-Fc主要在病毒内化阶段发挥阻断作用。将rAAV接种仔猪，定期监测猪血清中的游离受体含量，发现可持续35-40天，二次接种后，可继续表达30-35天。随后进行PRRSV攻毒保护试验，从临床症状、病理观测、病毒血症、组织器官病毒载量等方面评价抗病毒效果，结果证实，rAAV接种仔猪后能有效抑制PRRSV感染，且对PRRSV不同毒株均有抑制作用，说明rAAV介导的游离受体可以为猪体提供被动免疫来抵御PRRSV感染。.本研究构建的rAAV可作为PRRS防治生物制剂进一步开发，为PRRS防控提供了新的思路，也为其他易变RNA病毒的抗感染研究提供了有益借鉴。