蛋白激酶Plk1调控人端粒酶催化亚基hTERT的功能研究

The Plk1 (Polo-like-kinase 1) is a Ser/Thr protein kinase, which is increasingly recognized as key regulators during cell division through phosphorylation of different substrates. It regulates G2/M transition, spindle formation, chromosome segregation and process of cytokinesis. Recent research has prompted that the Plk1 is also involved in telomere replication, but the molecular mechanism is not clear. Our preliminary data indicated that Plk1 can interact with telomerase catalytic subunit hTERT. We also identified the binding region of hTERT with Plk1. More importantly, we found that Plk1 can phosphorylate hTERT. In order to investigate the molecular mechanism of Plk1 in regulating the replication of telomere and the activity of hTERT, we propose to accomplish the following specific aims: (1) To identify the phosphorylation site(s) of hTERT by Plk1, and analyze whether its phosphorylation affects its telomerase activity; (2) To analyze whether Plk1 regulates the association of hTERT with hTR and the subcellular localization of hTERT as well as its stability ; (3) To study the correlation of the activity of Plk1 and hTERT during different phases of cell cycle and reveal the relevance of Plk1 and hTERT with cell proliferation and tumorigenesis.

Plk1 是一种在细胞周期调控中起关键作用的蛋白激酶，近年来有研究提示Plk1参与端粒复制的调控，但分子机制尚不明确。我们前期研究发现Plk1可以结合端粒酶催化亚基hTERT, 初步结果显示hTERT能被Plk1磷酸化。为了阐明Plk1调控端粒酶活性的分子机制，我们拟进行以下几个方面的研究：（1）确定Plk1对端粒酶hTERT的磷酸化位点；（2）分析PLK1对hTERT磷酸化修饰是否影响端粒酶活性和端粒复制；同时研究Plk1是否影响hTERT与端粒酶RNA（hTR）的结合以及hTERT在细胞内定位和稳定性；（3）通过分析临床样本和小鼠成瘤模型，明确Plk1表达水平与hTERT活性的相关性，并了解hTERT磷酸化修饰在肿瘤发生发展中的作用。通过上述研究揭示Plk1调节端粒酶活性及端粒复制的机理，为探索Plk1协同hTERT在调控细胞增殖及肿瘤发生发展中的作用提供思路和基础。

端粒酶是维持端粒长度的一种逆转录酶，对细胞增殖和癌变起重要作用。端粒酶的催化亚基TERT是它的限速成分，正常人体细胞中端粒酶的活性受到抑制，但是85%以上的肿瘤细胞通过上调TERT来活化端粒酶。因此TERT是正常细胞转变为肿瘤细胞的关键性蛋白，是抗肿瘤治疗的重要靶点，而目前对于TERT这一限速成分的调控机制尚不完全清楚。研究表明端粒酶的活性随着细胞周期的进展而呈现不同的水平，提示细胞周期调控相关蛋白可能参与其活性的调节。我们的研究旨在发现一种新的端粒酶活性的调控机制，阐明细胞周期网络调控系统与端粒酶活性的相关性。. 我们通过免疫共沉淀实验筛选到Polo样激酶1(Plk1)是一个新的hTERT相互作用蛋白，它可以与有活性的端粒酶复合物结合；同时我们证实了Plk1通过氨基端与hTERT结合并且Plk1的激酶活性不影响Plk1与hTERT的相互作用。进一步的实验表明Plk1敲低导致端粒酶活性下降，相反，Plk1过表达可以上调端粒酶的活性。通过分析我们发现过表达Plk1可以上调hTERT的蛋白表达水平并且延长hTERT蛋白的半衰期从而提高它的稳定性，这是通过增强hTERT与染色体的结合和抑制hTERT的泛素化降解两个途径来实现的。上述结果证实了Plk1是通过增加hTERT蛋白的稳定性来正向调节端粒酶活性的，该研究有助于我们了解Plk1在肿瘤发生发展过程中所起的作用，为寻找新的抗肿瘤靶标提供理论依据。