化学污染物表观遗传毒性的EGFP评价方法研究

人类基因启动子区DNA去甲基化可以导致下游基因的异常高表达，是化学污染物导致肿瘤等健康损害的表观遗传起始分子事件。评估化学污染物去甲基化能力是化学品安全性评价的新问题，目前国内外尚无相关表观遗传毒性评价的实用工具。利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）无毒、自发荧光、易于检测的特点，本项目将pEGFP-C3质粒进行甲基化修饰处理后，再转染进入人类HepG-2肝癌细胞株，并以该重组细胞株为工具评价化学污染物的表观遗传毒性。GFP基因启动子区DNA 甲基化水平降低，GFP蛋白表达量上升，绿色荧光增强；反之则GFP蛋白表达量下降和荧光减弱；化学物与该重组细胞株共培养后，通过细胞荧光强度变化可快速评估其致DNA甲基化改变的表观遗传毒性。本项目着眼于学科交叉，借助报告基因技术构建污染物去甲基化损害能力评价方法，是对化学污染物表观遗传毒性识别策略和研究工具的积极探索。

人类基因启动子区DNA去甲基化可以导致下游基因的异常高表达，是化学污染物导致肿瘤等健康损害的表观遗传起始分子事件。评估化学污染物去甲基化能力是化学品安全性评价的新问题。本项目着眼于学科交叉，借助报告基因技术初步研究污染物去甲基化损害能力评价方法，是对化学污染物表观遗传毒性识别策略和研究工具的积极探索。将甲基化处理重组pEGFP-C3质粒转染进HepG-2细胞，以5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)为阳性去甲基化毒物与转染细胞共培养，本项目在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、EGFP蛋白等多个层次证明了5-Aza-CdR染毒处理与其去甲基化能力的响应关系。当5-Aza-CdR 的染毒梯度为0.00016，0.0008，0.004，0.02μM时，细胞EGFP荧光强度均数与5-Aza-CdR存在良好的剂量效应线性关系，线性方程为y = 0.640ln(x) + 10.284；R2 = 0.890。低至0.00004μM剂量的5-Aza-CdR，其去甲基化能力也可以被定量检测。重复试验显示方法的变异度介于7.5~23.9%之间。利用该方法对典型化学污染物氯化镉、氯化镍；淮河流域部分地区地表水、地下水；天津污染海岸部分水产的表观遗传毒性实施了评价。以其重金属提取物为测试样品，去甲基化能力以5-Aza-CdR当量表示。检测结果显示氯化镉的去甲基化能力相当于5-Aza-CdR的0.75倍；氯化镍的去甲基化能力相当于5-Aza-CdR的0.36倍。地下水和底泥样品重金属提取物均检测出具有一定的去甲基化能力。9种水产样品重金属提取物的去甲基化能力较强，范围介于0.0064-0.0387μM 5-Aza-CdR当量之间，占总体18种受试样品的50%。该研究方法有望在化学品的健康危害能力评价，环境样品的健康危害效应检测，食物样品的表观遗传毒性评估等领域得到进一步的推广应用。