WIP1磷酸酶调控小鼠胚胎造血干细胞发育的功能和机制

Understanding the basic dynamic and mechanisms of hematopoietic stem cells (HSCs) development is important for regenerative medicine. Moreover, there is no appropriate strategies for derivation of functional HSC from ES cells. So far, understanding about the regulatory mechanisms of emergence, maturation and expansion of HSC in mouse embryos are limited. The wild-type p53-induced phosphatase 1(WIP1) participates in proliferation and differentiation of many cell types and is needed of T and B lymphopoiesis. We have found WIP1 phosphatase is important for HSC development in the AGM and fetal liver by in vivo and in vitro assay using WIP1 gene knockout embryos. According to our primary data, we will examine the effects of WIP1 gene loss on the development of hemogenic endothelium/Pre-HSC/HSC, and hematopoietic progenitor cells by flow cytometry analysis, CFU-C and HSC transplantation assay. Particularly, we aim to elucidate the regulation effects of WIP1 gene on distinct development stages during embryonic hematopoiesis, and delineate the changes of proliferation, apoptosis, and differentiation in WIP1 gene null HSC. Furthermore, we will use signaling pathway analysis and microarray expression profiling to uncover the underlying mechanisms. This study will provide some new insights and strategies to improve efficiency of hematopoietic differentiation from pluripotent stem cells.

深刻认识造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）发育的基本规律和调控机制对造血系统的再生研究意义重大，尤其，胚胎干细胞定向造血干细胞分化极为困难，其瓶颈为造血干细胞前体的成熟障碍。然而，胚胎期造血干细胞的发育调控机制仍有很多未知。WIP1磷酸酶参与多种细胞的正常增殖和分化，亦与淋巴细胞的成熟和功能有关。我们前期研究通过基因敲除小鼠胚胎，采用体内、外功能实验初步发现WIP1基因对胚胎AGM区和胎肝造血干细胞的发育和功能非常重要。基于此，本研究将首先采用流式分析、造血集落培养及体内移植等手段全面阐述WIP1基因的造血调控作用，明确其调节造血干细胞发育轴（生血内皮/造血前体/造血干细胞）的具体阶段，并从细胞增殖、凋亡及分化等方面，结合信号通路分析和表达谱芯片挖掘潜在的调节机制和作用靶点，最终为揭示造血异常相关疾病的发病机理和造血系统再生策略提供理论依据和重要线索。

胚胎期造血干细胞(hematopoietic stem cell ,HSC)的产生、维持、扩增和分化与其所在位点（主动脉-性腺-中肾(AGM)区，卵黄囊，胎盘，头部和胎肝）密切相关，最早的HSC由主动脉内皮细胞经内皮-造血转化过程产生和成熟，多种转录因子和信号通路参与HSC其中，然而，关于胚胎期造血干细胞成熟的机理却知之甚少。野生型p53诱导的磷酸酶(Wild-Type p53-Induced Phosphatase, WIP1)是一种丝/苏氨酸磷酸酶，前期研究表明其参与多种肿瘤发生，调控成体HSC分化、衰老及炎症细胞的功能，但是WIP1在胚胎期造血干细胞发育和分化中的作用未知。本研究中，我们采用WIP1敲除胚胎，通过组织学、细胞生物学、和分子生物学等手段研究WIP1缺失对胚胎期各级造血干、祖细胞的作用和机理。我们发现WIP1缺失导致AGM区、卵黄囊、胎盘和胎肝等组织各类造血祖细胞的频率和数目显著减少。E12.5-14.5 WIP1缺失胎肝的造血干细胞比例和数目减少，移植能力降低，移植后T、B细胞分化能力下降。最显著的是，直接移植E11.5 WIP1-/- AGM区未检测到HSC，E12.5 AGM区HSC显著减少，B系分化下降。进一步观察发现，WIP1缺失胚胎体内可以产生造血祖细胞，内皮生血能力基本正常，但缺失大的体内造血簇，流式分析表明，造血干细胞前体Pre-HSC I（(CD31+ CD41LOW CD45-)比例基本正常，而Pre-HSC II(CD31+CD45+)的比例和数目显著降低，体外OP9-DL1共培养后移植实验证实WIP1缺失Pre-HSC具有一定的重建能力。同时，WIP1的特异性抑制剂（CCT007093）可显著抑制两类Pre-HSC的成熟。机理分析显示，WIP1缺失胚胎Pre-HSC I和II细胞增殖增加，细胞周期异常。有趣的是，与AGM区不同，在E11.5卵黄囊中可以检测到长期重建能力的造血干细胞。同时，一些造血调控转录因子如Runx1、GATA-2等在WIP1缺失胚胎AGM区表达显著减少，而在同期的卵黄囊中表达增加。综上，WIP1是胚胎期造血干、祖细胞发育的重要调控因子，调控发育中期Pre-HSC的成熟；同时，WIP1对HSC发育的调控作用存在阶段和位点特异性，强调了这一过程的精确性和复杂性，对造血系统疾病和血液系统再生研究具有重要意义。