补肾养阴法调节PI3K/AKT信号通路促进干细胞治疗化疗后卵巢早衰的机制研究

Our previous researches show that intravenous injection of MSCs into rats with chemotherapy-induced ovarian failure(POF) improved ovarian function and the curative effect could be even better by adding Chinese recipe of replenishing vital essence to tonify the kidney(CRRVE). We found the CRRVE could lead stem cells to the location of disease and reduce the immunologic rejection reaction caused by stem cells transplantation, but the specific mechanism (Signal Pathway) is unclear. PI3-K/AKT Signal Path could regulate the apoptosis of cells and activate primordial follicles. So we brought forward a hypothesis that, by regulating the PI3-K/AKT Signal Path, the CRRVE could fulfil these functions which we mentioned above. The project intends to use the modern techniques of cell cultivation and Molecular Biology to do such researches as follows: ①The mechanism of PI3-K/AKT Signal Path during regulating follicular development. ②Whether PI3-K/AKT Signal Path takes part in the occurrence and development of POF. ③To observe the change of PI3-K/AKT Signal Path in POF model after using stem cells and CRRVE ,thus to make it clear that whether CRRVE could lead stem cells to the location of disease by regulating this signal path to prevent and cure POF, which could provide a new target spot and experimental evidence for the further clinical application.By combining the traditional Chinese recipe with the modern genetic engineering and bioengineering,exploring the theoretical essence of "the kidney being the origin of congenital constitution", the research is an entry point of modernization of Traditional Chinese Medicine(TCM). It also fills the blank in preventing and curing POF by applying TCM ,and probes into the new model of combination of TCM and Western Medicine.

前期研究显示干细胞移植可使化疗导致的卵巢功能损害得到不同程度恢复，而加用补肾养阴方药可以指导干细胞直达病所，减低移植所引起的免疫排斥反应，但其具体机制不详。PI3-K/AKT信号通路可调节细胞凋亡及原始卵泡的激活，因此提出假说补肾养阴方药是通过调节该通路、引导干细胞归巢、延缓卵巢颗粒细胞凋亡、进而达到修复受损的卵巢功能作用。本课题拟运用细胞培养、分子生物学等技术，旨在研究：①PI3-K/AKT信号通路在正常卵泡发育中的起效机制；②PI3-K/AKT信号通路是否参与卵巢早衰疾病的发生、发展；③观察应用干细胞及补肾方药后PI3-K/AKT信号通路的变化情况，探讨补肾养阴方药是否通过调节该通路来引导干细胞归巢，进而达到防治卵巢早衰的目的，为该病的防治提供新靶点及实验依据。本项目将我国传统中药制剂的使用与基因工程、组织工程相结合，进一步探讨"肾为先天之本"的理论实质，是中医药走向现代化的新模式。

前期研究显示干细胞移植可使化疗导致的卵巢功能损害得到不同程度恢复，而加用补肾养阴方药可以指导干细胞直达病所，减低移植所引起的免疫排斥反应，但其具体机制不详。PI3-K/AKT信号通路可调节细胞凋亡及原始卵泡的激活，因此提出假说补肾养阴方药是通过调节该通路、引导干细胞归巢、延缓卵巢颗粒细胞凋亡、进而达到修复受损的卵巢功能作用。项目主要通过动物实验和细胞实验两方面着手，探讨补肾养阴方药是否通过调节PI3K/AKT信号通路来保护卵巢颗粒细胞，以及减缓卵巢功能损害的微观机制，为补肾养阴方药防治化疗后卵巢早衰的研究提供实验佐证。实验结果显示：1. 模型组出现动情周期紊乱，逐渐至动情周期消失；各治疗组出现周期紊乱时间均晚于模型组，以干细胞+补肾养阴组出现周期紊乱时间最晚。2. 随着给药时间的推移，与模型组比较,各治疗组大鼠体重均有不同程度增加（P﹤0.05），干细胞+补肾养阴组显著增加（P﹤0.01）。3. 各治疗组与模型组比较，卵巢、子宫重量均有所增加（P﹤0.05），干细胞+补肾养阴组卵巢、子宫重量则显著增加（P﹤0.01）。4. 模型组较空白对照组E2含量显著下降（P<0.01），FSH、LH含量显著升高（P<0.01）；除抑制剂组外，其余各治疗组E2含量显著升高（P<0.01），FSH、LH降低（P<0.05），以干细胞+补肾养阴组最明显（P<0.01）。5. 各治疗组与模型组比较，卵巢中PI3K、AKT1、AKT2、Foxo3a、P27蛋白表达降低（P<0.05），以干细胞+补肾养阴组最明显（P<0.01）。研究结果提示：1. 补肾养阴药及干细胞治疗对化疗所致的卵巢早衰皆有一定的治疗作用，但两者结合应用疗效更佳。2. PI3K/AKT信号通路参与卵巢早衰疾病的发生。3. 应用干细胞及补肾养阴药能一定程度激活PI3K/AKT通路。4. 补肾养阴方药能通过调节此通路来引导干细胞归巢，调控机制可能是抑制该通路的过度激活，下调下游调控因子Foxo3a、P27以及减少PI3K、AKT1、AKT2在卵巢中的表达，有效防止卵泡的过早耗竭，进而达到防治卵巢早衰的目的。