低温疗法脱除草莓病毒及其表观遗传变异研究

植物病毒对草莓生产具有很大危害，发展新的脱毒技术是生产的需要。低温疗法脱毒技术是在植物超低温保存茎尖的基础上发展起来的新的脱毒技术，具有先进实用的优点，但其脱毒再生材料的遗传表现与分析尚无报道。本研究拟建立起草莓的低温疗法脱毒技术体系，对草莓生产中4种主要危害病毒进行脱除研究，并对4个品种的低温疗法脱毒再生材料与传统茎尖培养脱毒材料的田间农艺性状进行对比分析，采用荧光AFLP,cDNA-AFLP和MSAP等技术对两种脱毒材料分别从DNA序列、基因表达与表观遗传等层面进行比较分析，从而为低温疗法脱毒技术在草莓上的应用打下技术与理论基础。

植物病毒严重危害了草莓的生长和发育，对广大果农造成了重大的损失，我们将一种全新的脱毒技术——低温疗法应用在了草莓上，并取得一定成果。本项目研究期间通过PCR和RT-PCR技术筛选并建立了感染轻型黄边病毒(SMYEV)全明星草莓的单芽系，同时还建立了蛇莓、马铃薯、留兰香、五叶草莓等的单芽系；改进并优化了玻璃化超低温保存体系，完成了对全明星草莓、蛇莓、马铃薯、留兰香、五叶草莓等的超低温保存工作，优化后的玻璃化法超低温保存技术，使全明星 草莓的成活率达到了64.3%左右，使蛇莓茎尖的成活率达到42%，使马铃薯的成活率达到71.6%，使留兰香的成活率达到60%，使五叶草莓茎尖的成活率达到79.7%；利用RT-PCR技术检测并测算了带病毒草莓超低温保存成活后病毒的脱除率，结果显示：病毒脱除率高达93.0%，远远高于其他脱除草莓病毒的技术，能有效地脱除草莓病毒；分析了低温疗法脱除病毒之后的草莓和带病毒草莓以及本身不带病毒的草莓苗之间的农艺性状差别，发现脱除病毒后草莓植株长势较未脱除的好，然而和本身不含病毒的材料没有明显的区别；利用AFLP、MSAP和cDNA-AFLP技术分析了低温疗法脱除病毒前后的全明星草莓遗传稳定性以及甲基化水平的变化情况，低温疗法脱毒前后基因没有发生变异，甲基化水平降低1.82%，以及基因表达发生了一定的差异；也利用AFLP、MSAP技术分析了马铃薯、蛇莓、留兰香、野生五叶草莓的遗传稳定性以及甲基化水平的变化情况，同时研究了不同浓度的DMSO和甘露醇这两种超低温保存中常用的冷冻保护剂对拟南芥遗传基因稳定性以及甲基化水平的影响，未发现序列变异情况，但不同程度出现了甲基化变化；以拟南芥为材料，研究了超低温保存对外源基因转化及表达的影响，发现超低温保存对基因转化影响不大，但对转基因材料外源基因表达具有一定的促进作用，可能是与超低温保存引起基因组DNA甲基化降低有关。后续实验将继续探讨甲基化与基因表达水平之间的关系。