靶向胰腺癌干细胞的抗体及其分子靶标的研究

本研究在成功分离鉴定培养胰腺癌干细胞的基础上，应用本室建立的免疫蛋白质组学新技术，制备抗胰腺癌干细胞的功能性单抗库。采用一系列免疫学、细胞生物学及体内动物实验，筛选鉴定获得具有抑制胰腺癌干细胞自我更新能力、分化及体内致瘤性的抗胰腺癌干细胞的功能性单抗。应用这些功能性单抗进行临床相关性研究，阐明胰腺癌干细胞在胰腺癌发生,转移、复发及预后中的作用，从而进一步证明胰腺癌的肿瘤干细胞假说。同时至少选择2株功能性单抗在裸鼠体内进行靶向胰腺癌干细胞不同治疗方案的比较性研究。初步确定靶向胰腺癌干细胞治疗的优选方案，并提供抗体靶向治疗的候选单抗。在此基础上，用已证明有治疗潜力的功能性单抗，采用免疫亲和层析及蛋白质谱技术分离鉴定获得相应的功能性抗原基因，并在基因和蛋白水平上研究其功能及其作用的分子机制，以期为筛选靶向胰腺癌干细胞的其他药物提供候选靶点。

本研究成功从抗胰腺癌干细胞单抗库中筛选鉴定出2株识别不同胰腺癌干细胞亚群的功能性单克隆抗体。单抗15D2能够识别PANC-1细胞系中的CD24+的胰腺癌干细胞。抗体体外功能实验结果显示15D2能显著抑制PANC-1细胞在无血清培养基中成球，抑制率达到22%。同时，单抗15D2联合吉西他滨能显著抑制胰腺癌干细胞对吉西他滨的耐药，联合组和对照组IC50分别为0.10μmol/L、0.39μmol/L。15D2单抗靶向胰腺癌干细胞治疗胰腺癌的动物体内实验研究结果显示，高、中、低剂量的15D2单抗治疗组抑制胰腺癌生长的抑制率分别为80.9%、69.4%和58.2%，单抗联合化疗药吉西他滨治疗的抑制率为95.0%,但单用吉西他滨的抑制率为52.7%，且单纯化疗组肿瘤生长加快。这些结果表明靶向胰腺癌干细胞单抗15D2能治疗肿瘤的复发和耐药。IHC显示单抗15D2识别的抗原在胰腺癌组织中特异高表达阳性率为76.9%，在癌旁组织中表达低获不表达。另一株单抗15E9能特异识别HPAC中CD133+的胰腺癌干细胞，并能显著HPAC细胞的成球，抑制率达到30.43%。单抗15E9联合吉西他滨能显著HPAC球体细胞的增殖，两者IC50分别为30.8nmol/L和58.1nmol/L。IHC显示单抗15E9识别的抗原在胰腺癌组织中特异高表达阳性率为79.3%，而在癌旁组织中表达阳性率仅为8.6%。单抗15E9所识别的抗原分子为羧肽酶A4（Carboxypeptidase A4, CPA4）。免疫组化和ELISA检测发现CPA4在胰腺癌患者组织、血清中均特异高表达，且呈正相关。临床相关性分析发现胰腺癌组织中CPA4表达与胰腺癌的淋巴结转移、分期相关。胰腺癌患者血清CPA4水平为(1.695±2.093) ng/ml, 正常对照组血清CPA4水平为(0.123±0.251) ng/ml。临床相关性分析发现血清中CPA4含量与胰腺癌的转移、分期相关，进一步分析发现血清中CPA4诊断胰腺癌的能力优于CA199，其曲线下面积(ROC)为0.783。CPA4有可能成为胰腺癌的诊断的分子标志物和靶向胰腺癌干细胞治疗肿瘤的候选靶标。因此本研究成功从抗胰腺癌干细胞单抗库中筛选出了2株能够显著抑制胰腺癌干细胞的自我更新和耐药能力的单克隆抗体，为胰腺癌干细胞的靶向治疗提供有应用价值的候选靶标。