乙型脑炎病毒入侵环节中包膜糖蛋白关键氨基酸残基和肽段的识别与功能分析

Japanese encephalitis virus is a arthropod-borne viruse belongs to the Flavivirus genus within the Flaviviridae family, and causes epidemic encephalitis B jeopardized to people in our country, especially to children. The entry of Japanese encephalitis virus into host cells is the first step of the complete life cycle, and can be used as a target for drug and vaccine design. There are still many problems in Envelope glycoprotein-mediated entry mechanism. (1) the receptor of Japanese encephalitis virus remains unkown.(2) The viral endocytic pathway is still controversial. (3) the mechanism of membrane fusion remains unclear. Single particle tracking used in this project can be reveal the entry mechanism more intuitively and more entirely. First, we want to establish a dynamic tracking model about the entry of Japanese encephalitis virus into host cells, which will reveal the viral entry pathways through the analysis of dynamic interaction between viruses and host endocytic structures. Then, we will construct a series of E protein mutants, and compare the mutants with wild-type virus in the dynamic entry progress to identify and analyze the the receptor binding domain of E protein and some amino acid residues which are critical in membrane fusion. Furthermore, drug and siRNA inhibition assay will be performed to confirm the results. This study will provide strong theoretical basis for drug and vaccine design.

乙型脑炎病毒是黄病毒科黄病毒属虫媒病毒，由其引发的乙型脑炎是威胁我国人群特别是儿童健康的主要传染病之一。乙型脑炎病毒入侵宿主细胞是其完整复制周期的首要环节，也是设计药物和疫苗的理想靶标。由包膜糖蛋白E介导的病毒入侵机制仍有许多问题亟待解决，如：病毒的功能受体未知；内吞途径仍有争议；E蛋白介导的膜融合机制有待完善等。本项目针对这些问题，构建和筛选一系列E蛋白突变型病毒株，并采用单颗粒示踪技术更直观、全面和准确地揭示生理状态下病毒的入侵机制。在建立乙型脑炎病毒入侵活细胞动态示踪模型的基础上，大量统计和分析突变型病毒与野生型病毒在入侵过程中的差异，识别和分析E蛋白表面受体结合域和膜融合过程中的关键氨基酸残基。随后，利用其他一些传统的生物学手段，如：药物抑制、小干扰RNA以及生物化学等方法，对所获得的实验结果进行佐证。研究成果将为设计靶向或基于E蛋白的抗病毒药物或疫苗提供重要的理论依据。

乙型脑炎病毒是黄病毒科黄病毒属虫媒病毒，由其引发的乙型脑炎是威胁我国人群特别是儿童健康的主要传染病之一。乙型脑炎病毒入侵宿主细胞是其完整复制周期的首要环节，也是设计药物和疫苗的理想靶标。本项目对日本脑炎病毒囊膜蛋白（E蛋白）开展研究，从分子水平识别E 蛋白表面的受体结合域和膜融合过程中的关键氨基酸。首先，我们包装了乙型脑炎的感染性病毒颗粒，重组病毒颗粒以及病毒样颗粒，发现大部分多点或单点突变破坏了病毒颗粒的包装。亚细胞组分分离实验进一步确定 I0，ij，BC，FG 和 R9A 突变病毒无法进行包装； kl，E373A，F407A，L221S 和 W217A 包装的病毒颗粒不能分泌释放的细胞外。同时我们还发现 N154 糖基化位点 和 DE loop 并不是进入宿主细胞系的受体结合域；参与结构域I和结构域III相互作用的两个氨基酸H144，H319，以及和结构域II形成茎区拉链结构的T410 和 Q258对保持病毒融合活性及其重要。最后我们还发现适应性突变 E138K 和 D389G 能够通过静电作用增强病毒吸附能力从而恢复突变型病毒的感染性。本项目揭示了E蛋白肽段和氨基酸残基在入侵宿主细胞过程的关键作用，为药物和疫苗设计提供合适的靶标。