CYP3A4启动子区DNA甲基化对肝移植病人术后他克莫司药动学的影响及分子机制

CYP3A4 in content is the most abundant in human liver and mainly responsible for tacrolimus metabolism. The activity of CYP3A4 directly affects the efficacy and toxicity of tacrolimus. Currently, it cannot well be explained from the classic genetic variation that CYP3A4 affect tacrolimus pharmacokinetics in early post-liver transplant patients. However, with the deepening of the research, it seems that epigenetics play an important role in addressing this problem. Based on the previous research and background at home and abroad, we proposed that DNA methylationin promoter region may influence the expression of CYP3A4, DNA methylation of CYP3A4 response elements in promoter region may affect the binding of its own and nuclear receptors, and DNA methylation of CYP3A4 may affect tacrolimus pharmacokinetics in the donor liver transplantation patients. This project will include cell regulation and clinical research. We will make use of a variety of techniques or methods such as TNT quick coupled transcription/translation system, bisulfite sequencing, gel electrophoresis mobility change, chromatin immune co-precipitation and dual luciferase reporter gene for this project. This study will help us to develop strategies for individualized therapy in liver transplant patients.

CYP3A4作为肝内含量最多的CYP450酶，参与了他克莫司大部分的代谢，其活性的高低影响了他克莫司在肝移植病人中的疗效和毒性。目前经典遗传学并不足以解释CYP3A4对他克莫司药动学影响的个体差异。然而随着研究的深入，表观遗传学可能成为解决这一问题的关键。基于我们前期的研究和国内外背景，本项目将从细胞模型以及临床二个层面，应用重亚硫酸盐测序法、TNT快速转录/翻译偶联法、凝胶电泳迁移率改变法、染色质免疫共沉淀法、双荧光素酶报告基因等方法来观察CYP3A4启动子区DNA甲基化可能对下游基因表达有影响，CYP3A4启动子区反应元件甲基化可能影响自身与核受体的结合以及肝移植供体CYP3A4基因甲基化可能影响FK506的药动学。该研究为他克莫司的个体化用药提供新的策略。

CYP3A4作为肝内含量最多的CYP450酶，参与了大部分的药物代谢。多项研究已经报道了CYP3A4的表达活性具有明显的个体差异，并展开了大量的多态性研究。但经典遗传学并不足以解释这种差异，然而表观遗传学可能成为解决这一问题的关键。本课题从表观遗传学的角度研究DNA甲基化对CYP3A4基因启动子区活性的调控机制。首先，我们用不同浓度的DNA甲基化酶抑制剂5-aza-2’-dC处理HepG2细胞96 h，利用qRT-PCR方法发现PXR和CYP3A4 mRNA的荧光表达值升高，且以10 μM/L的处理浓度效果最佳(p < 0.05)。接着我们在该浓度下顺序处理HepG2，观察到PXR和CYP3A4 mRNA的荧光表达值以120 h最明显(p < 0.05)。基于上述实验结果，我们用10 μM/L的5-aza-2’-dC并加入PXR质粒处理HepG2 96 h，观察到CYP3A4的mRNA表达量明显升高(p < 0.05)。利用生物信息学，我们在CYP3A4启动子区近端和远端选择了包括PCR结合位点的各1条片段，把它们构建入无CpG位点的pCpGL质粒，分别命名为pCpGL-pp（近端）和pCpGL-pdp（近端和远端）。两个质粒接着被用于由HepG2细胞构建的荧光素酶报告基因体系以研究DNA甲基化对CYP3A4启动子活性的影响。结果发现CYP3A4启动子近端CpG位点甲基化CYP3A4基因的表达影响不大，而在远端启动子片段存在的情况下甲基化对CYP3A4基因的表达有明显的影响(p < 0.05)，并且这种效应在加入PXR表达质粒的条件下仍不能逆转。此外，我们对临床收集的63 例肾移植术后服用他克莫司病人的外周血DNA样本进行了亚硫酸氢盐处理并执行焦磷酸测序，发现位于PXR结合域的CpG1及其上游8个碱基处的CpG2位点呈现高甲基化态（中位数分别为90 %和88 %），且与患者他克莫司C0值没有相关性。总之，DNA甲基化对CYP3A4基因启动子区活性具有调控的作用（尤其是远端启动子）；CpG1和CpG2在服用他克莫司的病人中呈现高甲基化态。项目资助发表论文1 篇，待发表1 篇。培养硕士生2 名，其中1 名已经取得硕士学位，另1 名在读。项目投入经费30 万元，结余8.00092 万元，支出21.99908 万元，各项支出基本与预算相符，剩余经费计划用于本项目后续研究。