耐低氧粪肠球菌临床分离株生物膜形成、功能及其相关分子机制的研究

Enterococcus faecalis (E. faecalis) is one of the main pathogenic bacteria for refractory periapical periodontitis. It is almost impossible for currently used chemo-mechanical techniques to eliminate the E. faecalis within infected root canals. It is well-accepted that E. faecalis can withstand the harsh environments such as a limited nutrition and a high pH value in endodontically treated canals. Further investigations found that the expression of hundreds of genes significantly changed when the E. faecalis located in a nutrition-limited or/and a high pH value environment (s). Similar changes in gene expression was also noted in our previous study, in which the E. faecalis was cultured under a low-oxygen-contented condition. How did the E. faecalis form biofilm in a low-oxygen-contented environment, and what’s the possibly related molecular mechanism? This is still a unsolved question. Basing on the preliminary data of our previous study, in which biofilm formation related gene of the low-oxygen-resistant E. faecalis isolate was selected using the high-throughput sequencing technique, the purpose of present project is to further illuminate the function and the related molecular mechanism of dnaK gene and its targeted proteins in the biofilm formation of the low-oxygen-resistant E. faecalis isolate.The findings in this research will provide both experimental evidence and new approaches for further investigation in the function and regulatory mechanism of biofilm formation of E. faecalis under specific living environments, and will provide us new targets or methods to develop novel anti-biofilm bactericidal and inhibitory agents.

粪肠球菌是难治性根尖周炎的主要致病菌之一，临床上往往综合现有的物理化学手段都难以彻底清除根管深部的细菌，学者们认为这些细菌能够在高碱、寡营养、低氧等特殊环境下长期“潜伏”，进一步研究发现，高碱和寡营养环境下，粪肠球菌的数百个基因表达有显著差异，我们前期的研究也发现在低氧环境中有类似的情况。那么作为兼性厌氧菌的粪肠球菌如何能在低氧环境下形成生物膜，有哪些可能的分子机制，目前尚不清楚。本课题拟在前期利用高通量测序筛选获得的耐低氧粪肠球菌生物膜形成相关基因的基础上，进一步明确dnaK基因及其调控的蛋白在耐低氧粪肠球菌生物膜形成过程中所起的作用以及相关的分子调控网络，为特殊环境下粪肠球菌生物膜形成的调控机制和功能研究提供实验基础和新的思路，并为研发新型抗细菌生物膜药物和抑制剂寻找新的靶点和途径。

经过治疗的根管内处于一种低氧的环境。粪肠球菌（E. faecalis）及其生物膜能够在此环境下长期生存并繁殖，因此成为难治性根尖周炎的重要致病因素之一。但是，E. faecalis在低氧环境中存活的分子机制目前尚未明确。项目负责人前期成功从难治性根尖周炎患牙根管中分离获得 E. faecalis 临床分离株，发现其在低氧环境下基因表达改变的同时可以与其他致病菌形成混合生物膜。基于当前对E. faecalis在低氧条件下致病机制认识的不足，本项目拟在前期研究基础上探索低氧条件下E. faecalis生物膜的形成、功能改变及其相关分子机制，为难治性根尖周炎的临床治疗提供新的思路和选择。. 本项目的主要研究内容包括：对低氧条件下的E. faecalis及其临床分离株在浮游及生物膜状态下的生存能力、超微结构、基因表达情况进行了测定；明确E. faecalis 和F. nucleatum等重要致病菌相互作用过程中的生物膜形成能力、毒力改变及可能的分子机制。本项目主要取得了如下成果：（1）分离鉴定了难治性根尖周炎中的E. faecalis临床分离株，并对其进行了生存能力的表征。（2）成功建立体外生物膜模型，明确低氧状态下不同分离株生物膜形成能力的变化，筛选出生物膜形成能力明显增强的4株。（3）筛选出E. faecalis耐低氧相关的调控基因dnaK。（4）临床实验明确E. faecalis在难治性根尖周炎中的检出率约为27.6%，且与F. nucleatum正相关。（5）体外实验发现F. nucleatum黏附蛋白Fap2介导E. faecalis 与F. nucleatum共聚集。（6）体外实验证明E. faecalis产生的H2O2和酸性环境是抑制F. nucleatum的主要原因。综上，本研究为低氧条件下E. faecalis生物膜的形成、功能改变及相关分子机制的研究提供了充分的理论和实验依据，为难治性根尖周炎的临床治疗提供了新的思路，有重要的理论研究和临床指导意义。. 此外，相关研究结果发表学术论文9篇，其中SCI 5篇；出版学科专著3部，其中英文专著1部；获中华口腔医学会科技奖二等奖；授权国家发明专利1项，实用新型专利3项；参加国内外学术交流12余次；培养博士5人、硕士研究生3人，其中5人已毕业。