粪肠球菌fsr基因在根管治疗后疾病相关生物膜调控机制的研究

根管治疗后疾病是牙体牙髓科临床常见病，发病率高，治疗难度大，是亟待解决的问题。粪肠球菌是其主要的致病菌，它能在牙本质小管深处形成生物膜，逃避机械化学方法的清理，是根管治疗后疾病发生的重要因素。粪肠球菌调节因子fsr基因属于粪肠球菌双组分密度感应信号系统，对细菌的毒力因子及代谢活动起着重要的调节作用。研究证实粪肠球菌fsr基因在其生物膜形成过程中起着重要的作用，但对于这一密度感应的调控机制未有明确报道。本课题拟构建粪肠球菌fsr缺陷株，利用差异显示PCR及蛋白质双向电泳技术对比研究突变株与野生株的基因、蛋白表达差异，以证实fsr密度感应调控机制的影响；并通过测序研究确定表达差异的结构基因，构建这些基因表达的标记株，在体外生物膜模型上动态观察这些受密度感应调控的结构基因在不同时相及生物膜上不同部位的表达差异，进一步研究其密度感应机制，进而寻求其相应的抑制因子，为防治根管治疗后疾病提供方法学依据

本课题开展的工作包括：.（一）PED标本采集。选择PED病例并利用Ca(OH)2进行根管内处理。无菌纸尖采集法收集根管内分泌物。（二）DNA提取。SDS法结合蛋白酶K进行样品的DNA提取。 (三)DNA扩增。根据口腔中微生物16SrDNA的保守序列去设计引物，选择引物rm和fm，（mf1:5'-AACW(A/G)GGATTAGATACCCX(A/T/C)GGTAGTCC-3'mr1:5'-GGACTACCY(G/A/T)GGGTATCTAATCCZ(C/T)GTT-3',）。设计合成引物fd和rd，（fD1 (59-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-39) rD1 (59-AAGGAGGTGATCCAGCC-39）。纯化产物定量后同一样品按前后两段等量混合，用于454文库构建。样品间采用barcode进行区分。（四）454测序。文库构建完毕后，用荧光定量的方法确定文库中分子的个数，然后进行Sv扩增，确定最佳的M./B.数，然后进行Lv扩增，收集阳性克隆珠子，用于测序。（五）数据分析。采用GS-FLX Software 去除衔接子区域和低质量序列, 屏蔽SMART PCR 引物。测序序列经CAP3 Software 进行拼接。所有分析使用默认参数。使用BLAST程序将拼接所得unigene与COMAV数据库比对(E 值<1e-5), 选取最佳注释。.研究结果：.（一）454测序结果。采用454 GS FLX Titanium 高通量测序技术对3个时间点的标本测序，获得481740条reads数，平均长度369bp。（二）Ca(OH)2治疗前后根管内微生物构成变化情况。PED病例在再治疗之前，根管内微生物种类多达248种，其中主要的五种细菌为Streptococcus , Enterococcus , Neisseria, Lactobacillus 和 Rothia，占据了微生物总数的88.44%。Ca(OH)2处理后，各个细菌的构成均发生了不同的变化。在Ca(OH)2处理一个月及一年之后，Enterococcus, Lactobacillus and Streptococcus的构成显著降低。而另外一些细菌的构成比则有相反的变化，包括Neisseria(从7.52% 到19.1% 和 14.4%),Rothia(从2.3% 到 2.5% 和5.0%).