杜梨盐胁迫DNA去甲基化酶基因PbDME的鉴定与耐盐调控机理研究

DNA Demethylases (DMEs) were induced by salt stress and changed the level of genomic DNA methylation, then the plant salt tolerance was improved. The DME genes play crucial roles on salt tolerance in plant. While many studies with salt stress have focused on its physiological mechanism of the effect of salinity on plant metabolism, considerably little interest exists on the epigenetic impacts of salt stress. Pyrus betulaefolia is one of the most important stocks for pear trees in salt tolerance breeding. However, the function and mechanism in salt tolerance of the Pyrus betulaefolia demethylase genes (PbDMEs) are still unclear. In this project, we are intent to carry out identification and expression analysis of PbDME family genes, VIGS screening, transcriptome and methylation sequencing after gene silencing and association analysis, candidate PbDME transgenic function verification, to screen out the PbDME genes which is closely related to the salt tolerance in Pyrus betulaefolia, elaborate the function mechanism of candidate PbDME in regulating the level of DNA methylation and gene expression, explore its excellent candidates, and provide excellent candidate gene for Pyrus betulaefolia germplasm innovation.

盐胁迫激活DNA去甲基化酶基因（Demethylase，DME）的表达，改变植物基因组DNA甲基化水平，增强植物耐盐适应性。DMEs对调控植物DNA甲基化水平和应对高盐逆境有重要的作用。但以往的工作大多集中在盐胁迫影响植物生理代谢方面，较少研究植物响应盐胁迫的表观遗传作用。杜梨（Pyrus betulaefolia）是栽培梨的主要耐盐砧木资源，而其DNA去甲基化酶基因（PbDME）在耐盐胁迫响应中的功能和调控机制尚不明确。本项目拟通过对杜梨PbDME家族基因的克隆、表达分析、VIGS筛选、候选PbDME基因经VIGS技术沉默后的转录组和全基因组甲基化测序及其联合分析、候选PbDME基因的转基因功能验证，以期筛选出与杜梨耐盐紧密相关的PbDME基因，探明其在杜梨耐盐响应中，调控DNA甲基化水平、进而调控耐盐基因表达的机理；发掘优异的PbDME候选基因，为杜梨耐盐种质创新提供科学依据。

对杜梨甲基转移酶（PbeMTase）基因进行了全基因组鉴定和进化分析，明确了甲基转移酶基因的分类，其在杜梨中可以分为4类，分别是MET、CMT、DRM和Dnmt2。共鉴定出三对直系同源基因，其Ka/Ks比值分别从PbeMET1a和PbeMET1b的0.232到PbeCMT2和PbeCMT3的0.251不等。在17条具有高度保守蛋白质序列结构的杜梨染色体中，所有12个MTase基因均位于9条染色体上。另外，在盐胁迫处理下，MTase基因和其他盐响应基因的表达谱揭示了它们在杜梨盐响应中的重要作用。此外，三个盐敏感基因（PbeNHX2.1、PbeCBL2和PbeAKT2）在盐胁迫下发现启动子（包含CpG岛）的甲基化水平发生了改变。尤其是PbeAKT2启动子区域表现出高度的CHG和CHH甲基化类型。该研究提供了一个全基因组的MTase基因家族的调查，并强调了它们在盐胁迫下的盐响应中的作用，为理解该基因家族的复杂功能奠定了基础。对DNA去甲基化酶基因进行了全基因组分析。研究发现，七个DME基因可根据其结构域，定义为PbDME1–7。且结果与基因结构特征和系统发育分析一致。DME基因的基因结构相对复杂。DME基因经历了发生在梨和苹果在分化之前的祖先种内的全基因组复制事件（WGD）。表达结果显示高盐胁迫可能会影响DMEs和盐敏感基因的表达水平。说明PbDME基因在盐胁迫和盐胁迫反应中发挥重要作用。对相关盐胁迫响应基因C3H基因进行了全基因组鉴定和表达分析。分析发现C3H家族基因存在于一些双子叶植物和单子叶植物中。它们的特点是具备一个标志性的结构域，由三个半胱氨酸和一个组氨酸残基组成，C3H基因在植物生长、发育过程和环境反应中起重要作用。通过全基因组的深入分析，共鉴定出117个杜梨PbeC3H成员，分为12组。基因结构C3H基因相对复杂，但在各组中都是保守的。通过分析发现，杜梨和苹果基因组中分别有35对和37对旁系同源基因，而杜梨和苹果之间有87对直系同源基因。除了一对直系同源基因PbeC3H66和MD05G1311700经历正向选择外，其他C3H基因都进行了纯化选择。表达谱显示，高盐胁迫会影响杜梨中C3H基因的表达。表明，PbeC3H基因在盐胁迫和盐胁迫反应中发挥重要作用。