用BMP7基因修饰的牙周膜干细胞和快速成型技术再生牙周缺损组织

采用干细胞培养分离技术，体外分离扩增犬牙周膜干细胞（PDLSCs），将具有强骨诱导活性的骨形态发生蛋白7基因导入PDLSCs内，使其长期稳定表达成骨活性，并大量扩增。同时建立犬牙周缺损模型，通过计算机辅助设计、三维重建和快速成型技术（RP），制备与牙周缺损形态结构相适应的、个性化纳米羟基磷灰石-胶原-聚乳酸和壳聚糖-胶原复合牙周支架。最后采用组织工程学方法，构建bmp7-PDLSCs、PDLSCs定向分布于RP复合支架的立体培养体系，并将其体内移植，治疗犬牙周缺损模型，以达到再生牙周组织，治疗重度缺损的牙周病的目的。本研究在近年来干细胞和组织工程迅速发展的基础上，首次将干细胞基因修饰和RP材料制备技术引入牙周组织工程化再生治疗领域，弥补了传统牙周治疗中因活性细胞不足和支架材料难以满足牙周复杂的组织结构等难题所带来的不足，有望能显著提高牙周生物再生效能，为牙周病治疗提供新的思路和理论依据。

目前牙周病的发病率已高达85%～90%。牙周病表现为牙周支持组织（牙槽骨、牙骨质、牙周膜）破坏，牙周附着丧失，最终导致牙齿松动脱落。牙周病不仅是牙齿缺失的主要病因，还与糖尿病、心血管疾病等多种疾病的发生发展密切相关，严重威胁人类健康。传统采用牙周洁治、刮治、根面平整等法治疗，只能在一定程度上控制病变发展，对已破坏的牙周组织再生修复成为难题。本项目采用组织工程学方法，以成骨基因BMP7修饰的牙周膜干细胞（PDLSCs）为种子细胞，将其与快速成形（RP）技术制备的生物支架材料复合，探讨重建牙周组织缺损的可行性和可靠性。项目组完成了：①人与犬PDLSCs原代培养分离及鉴定。②PDLSCs成骨特性及体内成骨能力研究。③BMP7基因转染PDLSCs及检测。④采用RP技术制备骨组织工程支架材料nHAC/PLA及HA/TCP，探讨其与PDLSCs的生物相容性分析。⑤建立了犬牙牙周软、硬组织缺损模型。⑥将PDLSCs与脱细胞真皮基质（ADM）复合，重建犬附着龈缺损，评价其修复效能。⑦将PDLSCs与HA/TCP及ADM复合，重建犬牙周软硬复合组织缺损，评价其修复效能。⑧将携带BMP基因的PDLSCs与RP支架材料复合，重建犬牙周缺损。研究结果如下：1)采用免疫磁珠法成功分离了人和犬PDLSCs，并进行鉴定，横向诱导结果显示PDLSCs在诱导条件下可分化为成骨细胞、脂肪样细胞。2)PDLSCs矿化诱导下可向成骨细胞分化，RT-PCR、Western blot结果显示其表达成骨细胞的标志基因和蛋白。3)采用腺病毒载体pAD/CMV/v5 Dest系统构建的Ad-BMP7腺病毒成功转入PDLSCs内，稳定表达BMP7及成骨相关基因和蛋白。4）采用RP技术制备的骨组织支架材料nHAC/PLA及HA/TCP与PDLSCs具有良好的生物相容性，将复合体植入裸鼠皮下均可形成骨样结构。5）将PDLSCs与ADM复合后可修复犬附着龈缺损， PDLSCs具有促进附着龈缺损修复作用。6）PDLSCs与RP支架材料HA/TCP及ADM复合可成功增高牙槽嵴高度达5mm，组织学显示缺损区有新骨形。BMP7-PDLSCs与个性化HA/TCP及ADM复合修复犬牙周缺损，初步效果良好，进一步研究在继续。本研究采用干细胞、基因工程、RP技术及组织工程技术，成功再生了附着龈、牙槽嵴缺损，为牙周再生治疗提供了新途径。