小麦高分子量谷蛋白基因甲基化修饰与表达关系研究

DNA methylation and transcriptional factors TaSPA/TaPBF/TaGAMYB are claimed to participate in regulating the gene expression of wheat high molecular weight gluten subunit (HMW-GS) sub-family, but the issue as to whether or not they could orchestrate the family is not well shaped. In this project, we propose to (1) study the difference in the methylation levels of HMW-GS genes in wheat non-seed organ and different developmental stages of grain as well as their transcription profiles to uncover the effect of DNA methylation on HMW-GS gene expression; (2) isolate the methytransferases/demethytransferases that influence DNA methylation level of HMW-GS gene, analyze their regulatory roles in HWM-GS gene expression; (3) compare the binding capacity of TaSPA/TaPBF/TaGAMYB to their targeting sequence with differential methylation levels, so as to realize whether or not the synergetic exerting porfermance of DNA methylation and TaSPA/TaPBF/TaGAMYB on HWM-GS gene expression, as well as the possible machanism. The perspective outcomes of this project will help us to get a further insight into the mechinaries for both supression and activiation of HWM-GS genes, and will also provide a new way for the quality improvement of wheat grains.

DNA甲基化和密切相关的储藏蛋白特异转录因子TaSPA、TaPBF和TaGAMYB参与谷蛋白家族基因表达的调控，但它们能否协同作用实现对该家族不同成员的多样性调控还不清楚。本课题拟检测小麦非种子器官/不同发育时期籽粒中高分子量麦谷蛋白基因甲基化的动态变化特征，通过与其表达水平的相关性分析，探讨甲基化对小麦高分子量麦谷蛋白编码基因表达的影响；筛选可能影响高分子量谷蛋白亚基基因甲基化修饰的甲基化/去甲基化酶，分析它们对麦谷蛋白基因甲基化修饰的调控特征；比较TaSPA、TaPBF和TaGAMYB与不同甲基化修饰水平的高分子量谷蛋白基因结合能力的差异，初步探索甲基化及TaSPA、TaPBF和TaGAMYB在谷蛋白基因表达中是否协同调控作用及其可能的机制。本课题预期结果将为进一步探讨小麦谷蛋白基因表达抑制/激活机制提供新的认识，并可为小麦品质改良提供依据。

小麦谷醇溶蛋白强烈影响面团的粘弹性，但其调控机制需要进一步明确。本课题研究了DNA甲基化抑制剂(5-azaC)和胚乳特异转录因子TaPBF对中国春基因组中Glu-1位点启动子区域DNA甲基化的影响。5-azaC处理后，小麦籽粒产量和谷蛋白的含量显著增加。进一步的研究发现5-azaC抑制了胚乳表达的相关甲基化酶的表达，而促进了在胚乳中表达的去甲基化酶的表达；胚乳发育相关的TaSPA、TaPBF和TaGAMYB表达上调显著，Western-blot显示TaPBF蛋白含量显著增加。蛋白定量分析显示小麦高分子量谷蛋白亚基1Bx7,1By8,1Dx2和1Dy12 RNA的表达量和蛋白含量显著增加。Bisulfite sequencing对中国春基因组中Glu-1位点1Bx7,1By8和1Dx2基因的启动子区域进行了测序，发现在未用5-azaC处理的情况下相比于小麦旗叶，发育中的胚乳甲基化水平显著降低；在5-azaC处理下，旗叶处理前后变化不大，而发育的胚乳甲基化水平处理后显著降低。将TaSPA和TaPBF转入济麦22中，结果发现谷蛋白的表达量显著增加，TaSPA和TaPBF表达水平显著增加，Western-blot显示TaPBF蛋白含量显著增加，而TaGAMYB的表达没有显著变化。利用亚硫酸盐测序结果显示，与野生型相比，尽管过表达体中在胚乳中表达的甲基化酶和去甲基化酶的表达没有显著变化，但在过表达体中甲基化水平显著降低。凝胶阻滞实验（EMSA）结果显示TaPBF-D可以和Glu-1位点启动子的P-box结合；免疫共沉淀结合qRT-PCR技术结果表明随着Glu-1位点启动子DNA甲基化水平的降低，TaPBF-D和P-box结合显著增加。以上结果表明Glu-1位点启动子区域DNA的甲基化在胚乳发育过程中会发生变化并通过与胚乳特异转录因子的结合促进了相关基因的转录和蛋白的积累。