流感病毒NP蛋白调控细胞周期的致病机制研究

Each year, influenza A virus threatens the life and health of human beings and it already resists to the neuraminidase inhibitors (NAIs). Therefore, there is an urgent need to develop antiviral drugs directed against new targets. To this aim, we still need to improve our basic scientific understanding of the key mechanism of virus-host interactions. In previous studies, we showed that influenza A virus induces cell cycle arrest in G0/G1 phase which is beneficial to increase virus titer and nucleoprotein (NP) expression. Since the effects also occur in other subtypes of influenza A viruses, the G0/G1-phase arrest is likely a common virus hijacks host cell machinery. However, how the NP protein regulates the cell cycle and contributes to the pathogenic mechanism is still unknown. Firstly, we will identify crucial sites of NP protein involved in the cell cycle regulation and mice pathogenesis. Secondly, we will profile regulatory networks and signaling pathways using the Cell Cycle Phospho Antibody Array to reveal key host factors interacting with the NP and regulating G0/G1-phase arrest. Thirdly, we will design in silico small molecules based on the structure of crucial sites on NP protein and identify the most effective and the least toxic using in vitro assays. In addition, we will validate the efficacy of the best small molecules targeting NP against NAI-resistant virus using an in vivo mouse model. Taken together, this project will characterize a novel pathogenic mechanism of influenza virus regulates the cell cycle by NP protein and it will provide a rationale to design drugs targeting the NP protein.

甲型流感病毒每年威胁人类的生命和健康，已对神经氨酸酶抑制剂产生耐药性，因此研究病毒和宿主关键的相互作用机制，是研发新抗病毒靶标的科学依据。我们之前的研究发现，流感病毒诱导宿主细胞周期滞留于G0/G1期，有利于提高病毒复制量和NP蛋白的表达量，此现象在不同亚型的病毒中广泛存在，可能是病毒挟持宿主细胞的通用机制。然而，流感病毒是如何通过NP蛋白调控细胞周期的致病机制未明。本项目拟首先鉴定NP蛋白调控细胞周期的关键作用位点和对小鼠致病性的贡献；其次，经细胞周期通路磷酸化抗体芯片，剖绘NP蛋白关键作用位点影响的细胞周期调控网络和信号通路，揭示关键宿主因子与NP蛋白的相互作用。最后，经人工智能设计小分子药物、在体外筛选且在体内验证以NP蛋白关键位点为靶标的小分子抑制剂在耐药性毒株感染小鼠中的治疗效果。本研究将揭示未知的流感病毒NP蛋白调节细胞周期的致病机制，并提供以NP蛋白为靶标的药物设计理论基础。

甲型流感病毒可以迅速逃脱季节性疫苗提供的保护，或对现有药物产生耐药性。因此，迫切需要其他方法来干扰病毒生命周期和宿主的细胞周期。因此研究病毒和宿主关键的相互作用机制，是研发新抗病毒靶标的科学依据。甲型流感病毒的核蛋白（NP）是抗病毒干预措施的一个有希望的靶点。我们的研究发现，首先，甲型流感病毒诱导宿主细胞周期滞留于G0/G1期，有利于提高病毒复制量和NP蛋白的表达量，此现象在不同亚型的病毒中广泛存在，可能是病毒挟持宿主细胞的通用机制。其次，根据NP蛋白的RNA结合沟槽的口袋结构，在电脑进行蛋白质模拟，预测出新的功能位点。进而定点突变新的功能位点，在体外验证能拯救细胞周期滞留G0/G1期的NP蛋白关键作用位点。第三，经人工智能设计靶向NP蛋白口袋具潜在活性的148个小分子药物，在体外筛选出2个具备抗甲型流感病毒效果的小分子化合物，其中最有效、毒性最小的NP#6小分子化合物，不仅能抗病毒还能拯救细胞周期的G0/G1期滞留。最后，在体内验证了靶向NP蛋白关键位点的最佳小分子化合物对感染甲型流感病毒的小鼠的治疗效果，鉴定出NP#6是一种新型抗流感病毒小分子化合物。本研究揭示了流感病毒NP蛋白与细胞周期调控相关，为靶向NP蛋白的药物设计提供了理论依据。