三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶功能多样性及其调控机制

Serine proteases (SPs), a family of multifunctional proteases, play a crucial role in innate immune system. Until now, the study on SP function is limited in brachyuran crabs and the information about their regulatory mechanism remains deficient. In our previous study, four isoforms of serine proteases (designated as PtcSP1-3 and PtncSP) have been obtained from the swimming crab Portunus trituberculatus. In this project, PtcSP1-3 and PtncSP will be further investigated by molecular biotechnologies including quantitative Real-time PCR, recombinant protein expression, Western blot, immunohistochemistry and RNA interference. The function of recombined proteins of PtcSP1-3 and PtncSP will be analyzed. The expression pattern of their transcripts during the mating and spawning stages of female P. trituberculatus will be elucidated. The effect of RNAi targeting PtcSP1-3 and PtncSP on the total hemolymph phenoloxidase activity, the speed of hemolymph coagulation and the expression levels of regulatory gene (antimicrobial peptides, serine protease homologues and serine protease inhibitors) will be examined. The obtained results will provide valuable reference for understanding functional diversity of SPs and reproductive immunity of female crabs. This study will be useful in understanding crustacean immune defense mechanism and giving new insights into diseases control in crab aquaculture.

丝氨酸蛋白酶（Serine protease, SP）是先天免疫过程中重要的多功能蛋白酶类，目前对蟹类丝氨酸蛋白酶功能的报道尚少，其相关调控机制的研究几乎空白。本项目在前期获得三疣梭子蟹4种SP亚型（PtcSP1-3, PtncSP）基础上，应用实时定量PCR、蛋白重组、Western blot、免疫组化等技术，分析不同亚型的重组蛋白功能，阐明它们在三疣梭子蟹雌体交配前后和产卵前后的时空表达规律；同时应用RNAi技术，分析这些亚型被干扰后血淋巴中酚氧化酶活性、血淋巴凝结速度和相关调控基因（抗菌肽、丝氨酸蛋白酶同源物及其抑制剂）表达的变化，初步阐明丝氨酸蛋白酶的调控机制。本项目将填补蟹类不同发育阶段丝氨酸蛋白酶研究的空白，为深入理解雌蟹重要生理过程的免疫力变化提供参考；为全面理解丝氨酸蛋白酶功能的多样性奠定基础，对揭示甲壳动物免疫防御机制具有重要意义，也将为蟹病防治提供新思路、新方法。

本项目按照计划完成了预定研究内容和各项考核指标，确定了三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶5种亚型（PtcSP1-3、PtncSP和PtcSP）重组蛋白的功能，阐明了它们的时空表达规律，探究了丝氨酸蛋白酶与其同源物、抑制剂和抗脂多糖因子的作用关系。共发表SCI论文3篇，均发表在Q1区期刊；先后培养本科生3人，协助培养硕士生2人；参加国内、国际学术会议3次；申请发明专利3项；部分研究成果荣获山东省自然科学三等奖。.结合新发现的PtcSP亚型，系统研究三疣梭子蟹5种丝氨酸蛋白酶亚型的序列结构，阐明不同亚型的产生机制和进化地位，PtncSP和PtcSP是由同一个基因组位点编码，经mRNA前体可变剪接产生；PtcSP1-3分别由不同的基因组位点编码，且PtcSP2和PtcSP3亲缘关系较近。重组表达PtcSP1-3和PtcSP的Clip和Tryp_SPc 结构域、PtcSP的成熟肽段，其Clip结构域具有抑菌活性，其Tryp_SPc 结构域具有蛋白酶水解活性；PtcSP1-3的Clip结构域还具有微生物结合活性，推测这3种亚型可作为识别分子与细菌或真菌结合后发挥其抑菌作用。虽然PtcSP1-3和PtcSP在健康三疣梭子蟹各个检测组织中均有表达，但是表达模式不同；在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和毕赤酵母刺激后，其表达量变化显著，提示PtcSP1-3和PtcSP是清除入侵病原菌的快速应答因子和持续效应因子。通过蛋白重组和RNAi技术，初步阐明PtcSP与PtSPH1协同参与酚氧化酶原激活系统，丝氨酸蛋白酶抑制剂PtSerpin和PtPLC可能与至少一种胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样的SP形成复合物抑制酚氧化酶的活性，PtcSP2和PtcSP3可能作为上游调控因子参与三疣梭子蟹抗脂多糖因子的合成。以上研究成果全面揭示了三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶不同亚型的功能，初步阐明其与相关调控基因的作用关系，为深入认识和理解免疫功能基因及其调控网络奠定基础，为有效地进行病害防控提供了新方法和新途径。