术后疼痛调控的新靶点——microRNA的作用及机制研究

术后疼痛是围术期治疗的重要问题，寻找新的调控靶点是其研究热点。本课题拟采用小鼠后足切割疼痛模型，根据切割前后脊髓背角神经节miRNA microarray的研究结果，筛选差异表达明显的miRNA，并进一步采用northern blot法及qRT-PCR法加以验证；拟采用miRNA原位杂交和神经元免疫组化双标记法，观察筛选出的miRNA在脊髓背角神经节各类细胞中的分布变化情况，鉴定调节术后疼痛的关键miRNA。通过敲除或过表达该miRNA，进而明确其在体内对术后疼痛的影响。在细胞模型中，观察miRNA对其靶基因的作用，阐明其作用机制；拟采用动物模型，进一步从功能上对miRNA靶基因调节术后疼痛机制加以验证。本研究旨在从体外和体内实验探讨miRNA对术后疼痛的影响，揭示术后疼痛新的分子机制，为发现术后疼痛防治的新靶点提供理论依据。

脊髓背角中活跃的基因表达的调节在术后疼痛发展和/或维护中发挥着重要作用。微小RNA (microRNA,miRNA)负调节通过转录后的基因表达或特定基因的转录抑制参与基因调节。miRNA是一些长度为22核苷酸左右的非编码调控RNA家族。这些进化保守分子主要在转录后的水平干扰基因表达, 它们通过作用于特定序列的3 '目标信使核糖核酸的翻译区适度促进RNA降解，而其中一些抑制基因转录参与染色质重构。随着基因芯片技术的进步,miRNA的研究取得了一定突破，尤其是在疼痛机制研究领域。虽然许多miRNA在神经系统发现,他们的功能仍然很大程度上未被探索。.为了探索miRNA在转录后水平调节术后疼痛产生和维持的分子机制，本课题通过选用大鼠后足切割术后30min和3h作为观测的时间点，采用u ParafloTM microRNA芯片技术，比对切割同侧脊髓标本的microRNA，采用Differentially Expressed miRNAs (Pass Volcano Plot)的miRNA的标准值进行聚类分析（hierarchical clustering），并用实时荧光定量PCR方法在术后15min，30min，3h，4h，6h加以了验证。芯片结果提示后足切割术后脊髓背角神经节中有4个miRNA表达显著上调，1个microRNA表达显著下调。实时逆转录聚合酶链反应揭示了相似的结果。我们采用miRNA原位杂交和神经元特异性抗原免疫组化双标记法观察脊髓背角中各miRNA的分布变化情况，在术后30min，3h大鼠脊髓背角miR-99a分布显著减少。通过合成miRNA抑制剂“antagomirs”以及miRNA激动剂 “agomirs”，建立特异性miR-99a敲除的以及过表达大鼠模型，证实了其与切割后机械性痛觉过敏及其它痛觉形式（热刺激及自发性疼痛等）的相关性。最后通过查阅文献以及利用数据库MIRANDA, TARGETSCAN, PICTAR对miRNA的靶基因进行预测，选取了靶基因中与疼痛相关的基因c-Fos蛋白，进行进一步的功能研究。我们的结果表明miRNA物种特定神经元迅速调节术后疼痛。本课题的实施不仅有助于对miRNA生物学功能进一步了解，也将为miRNA作为术后疼痛控制新靶点提供坚实的理论基础和潜在的临床可行性。