食源性致病菌克罗诺杆菌脂多糖分子的结构和功能研究

克罗诺杆菌是近年来在婴儿配方奶粉中发现的革兰氏阴性致病菌，易感染新生儿，导致脑膜炎和坏死性结肠炎等疾病，致死率高达80%，但其致病机理尚不清楚。近年来研究表明，有些革兰氏阴性细菌的致病能力与其脂多糖的精细结构及其菌膜形成能力密切相关。克罗诺杆菌脂多糖的精细结构是什么？菌膜形成能力如何？脂多糖结构与菌膜形成是否与其致病能力密切相关？这些重要的关键科学问题目前尚无定论。本项目拟采用生物信息学、比较蛋白组学和分子生物学等先进手段，深入系统地研究克罗诺杆菌脂多糖分子结构和合成途径、菌膜形成及其与致病能力之间的互作关联，从分子水平上解析克罗诺杆菌的致病机制。本研究不仅有利于针对性地设计检测和控制食源性致病菌克罗诺杆菌的新策略，而且对其它细菌脂多糖分子结构和功能以及菌膜发育相关领域的研究具有普遍的指导意义。

克罗诺杆菌是在婴儿配方奶粉中发现的革兰氏阴性菌，易感染新生儿，导致脑膜炎和坏死性结肠炎等疾病，但其致病机理尚不清楚。近年来研究表明，有些革兰氏阴性细菌的致病能力与其脂多糖的精细结构及其菌膜形成能力密切相关。本项目研究了克罗诺杆菌脂多糖分子结构与菌膜形成能力之间的关联，为从分子水平上解析克罗诺杆菌致病机制奠定基础。主要研究内容如下：①研究克罗诺杆菌的脂多糖分子结构多样性及生物合成途径。②研究环境温度对克罗诺杆菌的脂多糖分子结构的影响规律。③研究克罗诺杆菌的脂多糖分子结构与菌膜形成的关系。④构建克罗诺杆菌脂多糖分子结构突变菌，研究脂多糖结构对克罗诺杆菌致病能力的影响。主要研究成果如下：①提取纯化了克罗诺杆菌Cronobacter sakazakii BAA-894和Cronobacter muytjensii ATCC 51329的脂多糖分子，并分析其生物合成途径。②针对其脂多糖分子结构特点，发现阪崎克罗诺杆菌存在3个类脂A酰基脂肪酸链转移酶基因lpxL、lpxM和lpxP；通过在E. coli MKV15b中过量表达并纯化分析类脂A分子结构，确认阪崎克罗诺杆菌LpxM可以将C14:0或C12:0酰基脂肪酸链转移到类脂A分子的3'位上。③通过敲除庚糖基转移酶的编码基因waaC，改变阪崎克罗诺杆菌脂多糖分子结构，其菌膜形成能力也发生改变。与野生型BAA-894相比，waaC突变菌在亲疏水介质表面的菌膜形成能力增强，其细胞表面疏水性、外膜通透性、自凝集以及胞外物分泌量等都有了显著提高；表明阪崎克罗诺杆菌的脂多糖分子结构与菌膜形成能力密切相关。④阪崎克罗诺杆菌合成的类胡萝卜素能够提高其对干燥和酸性环境的耐受性，与其致病能力密切相关。所以，本项目也研究了阪崎克罗诺杆菌C. sakazakii BAA-894类胡萝卜素组分、结构及合成途径。⑤将研究扩展到其它革兰氏阴性菌，构建了一系列脂多糖分子结构突变菌，比较分析了不同结构脂多糖分子的内毒素活性，发现了类脂 A分子结构受温度变化影响的规律。这些研究不仅有利于针对性地设计检测和控制食源性致病菌克罗诺杆菌的新策略，而且对研究其它细菌菌膜发育具有普遍的指导意义。