食源性阪崎克罗诺杆菌中噬菌体逃逸CRISPR-Cas系统限制的分子机制

Cronobacter sakazakii，which can cause rare but life threatening diseases in neonates and infants through the contaminated powdered formula, has attracted global attention. We have found the type I CRISPR-Cas system in C.sakazakii by bioinformatics analysis, the latter is a new effective prokaryotic defense system against phages. CRISPR-Cas system is an obstacle for the implication of phage intervene and therapy in bacteria, it eventually to the selection of phages that are apt at evading CRISPR-Cas mediated resistance. And there is still no report about the mechanism of phage escape from the CRISPR-Cas system in C.sakazakii. Based on the full length of genome sequences from thirty C.sakazakii isolated from Chinese food and public dataset, we will analyze the distribution of prophages and the classification of CRISPR-Cas system What’s more, we will combine the bioinformatics method and experiments to investigate the mechanism of phages escape from CRISPR-Cas system of C.sakazakii from the mutation in specific region and anti-CRISPR-Cas system genes of prophages. This study is useful in understanding the co-evolution between virus and bacteria，and provides an important theoretical basis for the rational selection of phages in prevention and control of C.sakazakii in the future.

阪崎克罗诺杆菌污染引起的婴幼儿配方奶粉安全问题已经引起全球的高度重视。噬菌体是一种安全可行的预防和根除食物及其加工过程中微生物污染的方法。申请人发现阪崎克罗诺杆菌存在Ⅰ型CRISPR-Cas系统，它是新发现的原核生物防御噬菌体入侵的有效免疫机制，是噬菌体在防治宿主菌应用中的障碍，能够逃逸CRISPR-Cas系统限制的噬菌体具有选择优势。目前尚无阪崎克罗诺杆菌噬菌体逃逸CRISPR-Cas系统限制的研究。本项目利用实验室获得的30株中国阪崎克罗诺杆菌优势株和数据库中的全长基因组序列分析原噬菌体和CRISPR-Cas系统的分布情况，采用生物信息学分析和实验相结合的方法从噬菌体特殊位置的的碱基变异和抗CRISPR-Cas系统基因两方面研究阪崎克罗诺杆菌中噬菌体逃逸CRISPR-Cas系统限制的分子机制，有助于理解病毒-细菌的共进化，为合理设计噬菌体防治阪崎克罗诺杆菌的研究提供理论基础。

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是重要的食源性致病菌，感染婴幼儿可引起少见但致死率高的疾病，由其污染引起的婴幼儿配方奶粉安全问题已经引起全球的高度重视。阪崎克罗诺杆菌CRISPR-Cas系统可抵御噬菌体的入侵，是噬菌体防控宿主菌应用中的障碍。本项目通过阪崎克罗诺杆菌全长基因组序列进行分析，确定了该菌原噬菌体和CRISPR-Cas系统的分布类型和规律。阪崎克罗诺杆菌基因组中原噬菌体的总基因组大小与宿主菌的基因组大小有正相关的关系，噬菌体基因占了阪崎克罗诺杆菌泛基因组的16.57%，其中一些噬菌体基因可能是潜在的毒力因子，它的快速获得和丢失是宿主菌遗传多样性产生的主要原因。阪崎克罗诺杆菌含有I-E型和I-F型CRISPR-Cas系统，ST型与CRISPR-Cas系统具有一定的联系，临床株较之食品株含有更多的原噬菌体与前者CRISPR分子中spacer数量明显少于后者有关。原噬菌体和CRISPR分子的高变异性共同驱动了阪崎克罗诺杆菌的快速进化，后者的活性差异甚至推动了克罗诺杆菌属的种系形成及分化。通过Blast分析寻找间隔序列（spacer）对应的原型间隔序列（protospacer），确定PAM序列。通过构建插入PAM-protospacer序列的pUC19质粒和空载的质粒相对转化实验验证了阪崎克罗诺杆菌CRISPR-Cas系统的活性，同时构建PAM系列突变体质粒进行质粒相对转化率的比较，证实噬菌体可通过PAM突变方式逃逸CRISPR-Cas系统清除。利用目前最权威的生物信息学分析方法进行阪崎克罗诺杆菌CRISPR-Cas系统抗性基因的挖掘，并未发现该类抗性基因的存在。本项目初步阐明了阪崎克罗诺杆菌噬菌体逃逸CRISPR-Cas系统清除的分子机制，提供了病毒-细菌的共进化研究的新视角，为未来合理改造噬菌体防治阪崎克罗诺杆菌的研究提供理论基础。