翅果油树HPT和γ-TMT基因在高含量维生素E积累中的作用

Elaeagnus mollisis is a Chinese special woody-oil tree with high economical and ecological value. The vitamin E content in the seed oil is the highest of all kinds of oil plants, around 1.56mg/g. However, the molecular mechanism underlying the biosynthesis and accumulation of vitamin E in E. mollisis has never been studied. There are two genes, HPT and γ-TMT, have been showed as key genes in the biosynthesis of vitamin E in other species. In this study, HPT and γ-TMT will be cloned from E. mollisis through homology blast in the transcriptome and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The expression patterns of HPT and γ-TMT in different organs and different developmental stages of seeds will be detected using quantitative real-time PCR. The functions of HPT and γ-TMT will be analyzed through over expression and co-expression in Arabidopsis thaliana. In order to illustrate the biosynthesis and accumulation process of vitamin E, the vitamin E contents in the E. mollisis seeds of different developmental stages will be detected using high performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore, yeast two hybrid system will be used to screen the interactive proteins with HPT or γ-TMT and determine whether there is interaction between HPT and γ-TMT. Through integrated analysis the molecular function of HPT and γ-TMT in biosynthesis and accumulation of vitamin E, to provide an foundation for further study on molecular mechanism of high content of vitamin E in the seeds of E. mollisis.

翅果油树是我国特有的具有较高经济价值和生态效益的稀有木本油料植物，其种子油中维生素E含量是各种油料植物之冠，高达1.56mg/g，具有重要的开发和研究价值。然而，迄今关于翅果油树种子中维生素E合成与积累的分子机理研究仍处于空白。本项目通过转录组同源搜索和RACE技术在翅果油树中克隆参与维生素合成的两个重要基因HPT和γ-TMT的基因cDNA全长；利用实时定量PCR检测不同器官和种子发育过程中HPT和γ-TMT基因表达模式，通过在拟南芥中超量表达和共表达分析HPT和γ-TMT基因功能；利用高效液相色谱检测翅果油树种子发育中维生素E积累的动态趋势；此外，利用酵母双杂交筛选HPT和γ-TMT的互作蛋白并确定HPT和γ-TMT之间是否存在互作。通过整合分析HPT和γ-TMT在维生素E合成与积累的分子功能，为揭示翅果油树种子中高含量维生素E积累的分子机制奠定基础。

翅果油树不仅是我国特有的经第四世纪冰川作用后残存的古生物植物，也是我国重点发展的稀有木本油料植物，其籽油中维生素E含量最高达128mg/100g，具有重要的开发和研究价值。截至目前，关于翅果油树种子中维生素E合成与积累的分子机理研究仍处于空白。本项目从克隆翅果油树中与维生素E合成相关基因HPT和γ-TMT出发，通过过表达和共表达及转录调控层面分析两个基因的功能，取得以下研究结果：（1）转HPT的拟南芥种子中维生素E总量相对于野生型提高了1.12-1.19倍，α-生育酚含量提高了3倍；转γ-TMT的种子中维生素E总量是野生型的1.09倍，α-生育酚含量提高了5.4倍；转融合基因种子中维生素E总量提高了1.23倍，α-生育酚含量提高了6.15倍。此外，通过酵母双杂显示HPT和γ-TMT间未存在互作关系。由此推测HPT和γ-TMT表达特征可能不是决定翅果油树中高维生素E高积累的原因；（2）数字基因表达谱和qRT-PCR检测结果均显示HPT和γ-TMT在花和叶子中的相对表达量明显高于在种子中的表达量，符合维生素E在叶绿体中合成的事实；（3）对翅果油树4个发育阶段的种子进行数字基因表达谱分析及对脂肪酸和维生素E的含量和组分进行测定。研究发现，随种子不断发育，油脂积累与γ-生育酚/生育三烯酚和δ-生育酚/生育三烯酚积累规律一致，与α-生育酚/生育三烯酚积累规律相反，HPT，γ-TMT和TC的表达量均随种子不断发育呈逐渐降低趋势，可能导致种子中α-生育酚含量不断减少的原因之一。此外，在转录组序列基础上，开发多态性EST-SSR标记28个；（4）翅果油树野生资源变异丰富，不同种质的果实大小，籽油中脂肪酸和维生素E含量和组分差异明显，适合通过比较转录组学或关联分析发掘与油脂和维生素E合成与积累的关键基因。以上研究结果为翅果油树进一步开发和良种选育奠定了基础。