农杆菌基因协助下棉花花粉管通道高效转化体系的建立

棉花是新疆最重要的经济作物，在我国国民经济中占有重要的位置。利用基因工程技术将外源基因导入棉花细胞是现代遗传育种的重要途径。目前，各种转化方法在棉花上应用受到不同因素的限制。本项目根据农杆菌介导植物转化机理，将农杆菌Ti质粒上促进T-DNA转化的毒蛋白基因，在体外用脂质体同目的基因包装，然后采用花粉管通道技术，转入棉花。通过毒蛋白基因在棉花卵细胞或合子细胞内的瞬时表达，产生的带有核定位信号的毒蛋白与目的基因在胞内自行组装，并使目的基因向细胞核内定向转移，达到提高外源基因的转化效率和提高转化后代的遗传稳定性的目的，从而建立高效的棉花转基因技术体系。对于功能基因分析和转基因棉花育种，具有重要的科学和现实意义。

项目按原定计划完成了所有的研究内容，克隆了 VirD1、VirD2 和 VirE2 基因，并完成了这三个基因原核分泌型表达载体及植物表达载体的构建；成功改造了绿色荧光蛋白，并构建了植物表达载体 pBLG-pR1a-gfp,gfp5'端连接了信号肽 pR1a 序列，3'末端引入一段滞留在内质网中的特异序列 KDEL，增加了绿色荧光蛋白在植物中的表达，同时降低了 GFP 对植物潜在的毒害。用该载体转化烟草获得了转基因再生植株；对目的基因成功进行了脂质体包装并完成了烟草原生质体转化和棉花花粉管通道转化试验；试验结果显示： VirD1、 VirD2和 VirE2 基因之一或者全部参与花粉管通道转化的情况下，与对照相比能够提高转化效率，提高的效率并不显著，在有脂质体包装的情况下，VirD1、VirD2 和 VirE2 基因全部参与转化的情况下能够非常显著的提高花粉管通道法的转化效率，并显著提高结铃率，在其中一个获两个基因参与的情况下也能显著提高转化效率，但低于三个基因同时参与的转化效率。进一步通过 PCR 技术提取卡检显阳性的叶片 DNA，确定不同方法的转化效率，证实，通过构建 GFP＋VirD1+VirD2+VirE2+脂质体的花粉管转化技术体系，转化效率可以达到 4.7%左右，相应于其他转基因方法，转化率有了成倍的增加。