门冬酰胺合成酶互作蛋白与左旋门冬酰胺酶耐药的相关性研究

目前研究认为幼稚淋巴细胞内门冬酰胺合成酶（ASNS）活性增高是L-Asp的耐药机制之一。ASNS是一种看家基因，在细胞浆中发挥酶活性的功能。我们在前期研究中首次发现了ASNS还定位在细胞膜上，L-Asp能促进U937细胞膜上ASNS表达上调，由此提示ASNS具有除酶活性以外的另一种新功能。已有研究表明白血病细胞经L-Asp处理后，细胞膜上氨基酸转运体上调。基于上述，课题申请者推测ASNS位于细胞膜表面与细胞内外的氨基酸转运有关，L-Asp可能促使ASNS在细胞膜上表达增加，ASNS与氨基酸转运体相互作用，通过增强后者的转运能力而介导了L-Asp耐药。本课题通过串联亲和纯化技术探讨ASNS的互作蛋白将有助于阐明这些可能机制。从ASNS亚细胞定位及功能研究的层面探讨L-Asp在白血病耐药中的机制，将有助于更深层次以及更全面认识L-Asp的耐药机制，同时也将促进临床个体化治疗以及新药的开发。

成功引入左旋门冬酰胺酶(L-Asp)的联合化疗是提高儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）远期疗效一大主要原因。最近有观点认为L-Asp对某些亚型的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）也有良好的治疗效果。更重要的是：L-Asp的耐药程度直接影响临床预后。深入研究L-Asp的耐药机制，对改善儿童ALL预后、逆转因化疗耐药而复发，以及儿童白血病的个体化治疗中有着重要意义。目前研究认为幼稚淋巴细胞内门冬酰胺合成酶（asparagine synthetase, ASNS）活性增高是L-Asp的耐药机制之一，但也存在相反的结论。课题申请者认为，仅仅从ASNS mRNA基础表达水平似乎并不能完全解释L-Asp的耐药问题，目前对某些机制仍然知之甚少。课题申请者认为，ASNS不仅能指导门冬酰胺的合成，还可能参与了细胞某些重要生命活动，ASNS的亚细胞定位可能与其功能异质性相关。课题申请者构建了携带Flag 标签的ASNS基因真核细胞表达载体、杂交瘤方法制备ASNS的单克隆抗体，通过免疫荧光实验显示ASNS位于pIRES-GFP-Flag-AsnS/Neo转染组的细胞膜表面，分离细胞膜蛋白进行Westen blot分析同时证实了这一现象。U937细胞在L-Asp处理后，细胞膜的ASNS表达增强。ASNS分布于细胞膜上的现象可能提示了ASNS具有除酶活性以外的另一种新功能。细胞膜上的ASNS可能与氨基酸转运体相互作用，通过增强后者的转运能力而介导L-Asp耐药。通过构建慢病毒pLVX-IRES-ASNS过表达U937细胞系，串联亲和纯化（Tandem Affinity Purifieation,TAP）技术分离出U937稳定过表达ASNS细胞系细胞膜上的ASNS蛋白质复合体，目前正通过质谱分析对获得的互作蛋白的可信度和生物学相关性进行系统评价。但由于高度分化的细胞中目标蛋白质含量很低，纯化出的蛋白质复合体量较少，目前我们正通过选择更广泛亲和性和洗脱效率更高的TAP标签提高蛋白结合率及蛋白纯化效率。