栀子果实中西红花总苷合成途径CCD基因的筛选与功能分析

As carotenoid derived bioactive compounds and color agent, crocins originate from only a handful of medicinal plants, such as Crocus sativus and Gardenia jasminoides, through secondary metabolism. They have significant broad-spectrum anti-tumor activity against breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, etc. Besides, they are promising natural medicine to treat many incurable diseases. Because direct chemical synthesis is infeasible, crocins are quite expensive. Carotenoid cleavage dioxygenase, the key enzyme deciding metabolic direction and flux in crocin biosynthesis pathway, has not been cloned yet. The specific objective of this project is to screen and isolate the CCD gene from fruits of G.jasminoides, and analyze its catalytic characteristics through in vitro and in vivo expression, i.e. prokaryotic protein expression in E.coli and genetic transformation into maize. Morevover, predict cooperation between metabolites accumulation and expression of the CCD gene. Results from this proposed research project would enable us to decipher mechanism of crocin biosynthesis in plant, which will lay a solid foundation for our long-term goal to increase production through genetic manipulation.

西红花总苷是目前国际上的热点天然植物药，具有广谱抗癌活性，对多种疾病疗效明显，还可以用做高档色素。它是西红花和栀子等少数几种植物中的活性成分，含量很低，人工合成尚未成功，价格昂贵。类胡萝卜素剪切双加氧酶（Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD）是决定西红花总苷生物合成途径代谢方向和流量的酶，是调控西红花总苷合成的关键靶点。国内外学者致力于克隆该基因，但尚未成功。.本项目在对CCD家族进行全面系统发育分析的基础上，根据各分支设计功能域扩增引物，并获得了栀子果实中CCD基因的保守区段。拟从已构建的cDNA文库中筛选并克隆CCD基因，通过体外和体内催化反应试验进行全面可靠的功能鉴定。同时探索CCD基因对西红花总苷生物合成途径中代谢物积累的调控效应。成果将为西红花总苷代谢工程提供靶点，并为今后利用植物或微生物反应器生产西红花总苷奠定基础。

西红花总苷是目前国际上的热点天然植物药，具有广谱抗癌活性，对多种疾病疗效明显，还可以用做高档色素。它是西红花和栀子等少数几种植物中的活性成分，含量很.低，人工合成尚未成功，价格昂贵。类胡萝卜素剪切双加氧酶（Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD）是决定西红花总苷生物合成途径代谢方向和流量的酶，是调控西红花总苷合成的关键靶点。国内外学者致力于克隆该基因，但尚未成功。本项目从栀子果实中克隆了2个CCD基因，命名为GjCCD1基因和GjCCD4基因；并克隆了一个含有CCD蛋白完整编码框和一个内含子的基因组DNA序列。利用绝对荧光定量PCR法检测了GjCCD1基因和GjCCD4基因在栀子果实不同发育阶段和栀子不同组织中的表达情况。利用原核表达系统成功获得了GjCCD1蛋白和GjCCD4蛋白的可溶产物，并进行了蛋白纯化。建立了体外催化反应体系，构建了双质粒表达的体内催化反应体系，建立了利用高效液相色谱法检测CCD蛋白催化反应产物的反应条件和方法，进行了西红花总苷生物合成途径CCD基因的筛选。由于CCD基因在植物基因组中以多拷贝形式存在，不同的CCD蛋白剪切不同的底物，剪切位置多样，有些CCD蛋白底物特异性不同，在对GjCCD1蛋白和GjCCD4蛋白的催化功能进行研究时，尚需进行大范围底物筛选。