缺血性神经元necroptosis死亡中TNF-NO-BNIP3-AIF信号通路的研究

Necroptosis是最新确认的由肿瘤坏死因子(TNF)启动的程序性坏死，参与中风等很多病理过程。这一概念指出坏死也是可以调控的，对传统观念具有挑战性，但其具体机制还知之甚少。我们前期研究表明Bcl-2/E1B-19KD相互作用蛋白3(BNIP3)诱导凋亡诱导因子(AIF)核转位参与caspase非依赖性死亡，但尚不清楚这种死亡是否为necroptosis。AIF已被确认为necroptosis的重要分子，而TNF对necroptosis的敏感性依赖于BNIP3，这强烈提示BNIP3可能是necroptosis中TNF的下游分子，并且有关研究表明NO可能是其中间环节。我们推测脑缺血时TNF促进NO生成增加，诱导线粒体BNIP3上调，AIF由线粒体释放转位到核引起necroptosis死亡。通过本研究，我们旨在阐明参与necroptosis死亡的信号通路，为脑缺血保护治疗提供新的临床靶点。

细胞死亡存在于生理发育及众多病理过程中。传统观念认为细胞死亡分为凋亡和坏死两种截然不同的形式。Necroptosis是兼具凋亡和坏死特征的另一种细胞死亡形式，近几年的相关报道越来越多。2005年，necrostatin-1 (Nec-1，necroptosis特异性的抑制剂)，的发现开启了针对necroptosis的研究。.已有研究证明，necroptosis在中风中扮演重要角色，但是其分子机制尚不清楚。在本实验中，我们首先通过DAPI核染观察细胞死亡数和MTS检测细胞活性确定NEC-1对OGD/R诱导的神经元死亡具有保护作用（见附件实验进展图1-2）。其次我们通过观察NEC-1可以抑制OGD/R诱导的线粒体BNIP3上调（见附件实验进展图3）；NEC-1可以保护BNIP3过表达诱导神经元死亡（见附件实验进展图4-5）；过表达BNIP3可以逆转NEC-1的保护作用（见附件实验进展图6）来确定BNIP3参与OGD/R诱导的necroptosis死亡。接下来我们通过观察NEC-1可以抑制OGD/R诱导的AIF核转位（见附件实验进展图7）；推测AIF核转位也参与OGD/R诱导的necroptosis死亡。最后我们确定BNIP3和AIF核转位的上下游关系。我们观察到BNIP3过表达可以诱导AIF核转位增多（见附件实验进展图8）；干扰BNIP3的表达可以降低OGD/R诱导的AIF核转位（见附件实验进展图9）；AIF基因敲除可以降低BNIP3诱导的细胞死亡，提示BNIP3和AIF核转位的上下游关系（见附件实验进展图10）；通过观察NEC-1可以抑制BNIP3过表达诱导的AIF核转位（见附件实验进展图11），来确定BNIP3-AIF的上下游通路参与necroptosis死亡。.在本课题中我们研究确定在脑缺血损伤时，线粒体BNIP3上调，诱导AIF由线粒体释放转位到细胞核这一信号通路参与necroptosis死亡。这是首次对脑缺血necroptosis死亡通路进行比较系统而全面的研究。我们期望通过本实验可以进一步认识这一细胞死亡形式，完善脑中风神经细胞死亡机制，从而为将来研究相关药物，甚至为临床应用提供有力的证据。