华法林特异性靶蛋白VKOR在维生素K循环中的催化机制研究

Thrombotic disease is a kind of serious hazard disease to human health and life, especially in middle-aged an elderly people. Recently, the morbidity and mortality rate of thrombotic disease increased year by year, so it is urgent to carry out basic research and new drug development of thrombotic disease. Human Vitamin K epoxide reductase (hVKOR), a speed-limit enzyme in vitamin K cycle, is the target to develop new anticoagulants and antidotes of vitamin K antagonists. Warfarin, an usually used anticoagulant in clinical to inhibit blood coagulation, is such kind of drug to specifically target and inhibit hVKOR. However, There are problems of individual difference and narrow therapeutic window in use of warfarin. Currently, it is still unclear about the catalytic mechanism of hVKOR, and also controversial about the mechanism of warfarin inhibiting hVKOR. Our preliminary data found that hVKOR forms an intermediate complex with its substrate vitamin K epoxide (KO) during catalytic process, and we attempt to build a model of hVKOR catalyzing KO. On the above basis, this project will combine methods of hVKOR activity assay, protein mass spectrometry, molecular dynamics simulation, protein structure determination, et al, to systemically study catalytic mechanism of hVKOR, mechanism of warfarin inhibiting hVKOR, and molecular basis of hVKOR active site activating. So this study will provide important theoretical direction for the design of new specific anticoagulants and antidotes of vitamin K antagonists.

血栓性疾病是一类严重危害人类尤其是中老年人健康和生命的疾病，近年来其发病率和致死率逐年上升，因此开展与其相关的基础研究和新药开发十分迫切。人体维生素K循环中的限速酶hVKOR是开发新型抗凝药物和维生素K拮抗剂的解毒剂的靶点。临床上常用的抗凝药物华法林就是通过特异性靶向抑制hVKOR，达到抗凝血的效果，但其用药存在个体差异大，治疗窗口窄的问题。目前hVKOR在维生素K循环中的催化机制还不清楚，且华法林如何抑制hVKOR也存在争议。我们前期研究发现hVKOR在催化过程中与其底物KO形成了一种过渡态复合物，并初步构建了hVKOR催化KO的模型。本项目拟在此基础上，采用hVKOR活性实验、蛋白质谱、分子模拟和蛋白结构解析等方法系统地研究和阐明hVKOR的催化机制、华法林抑制hVKOR的机制和hVKOR活性中心活化的分子基础。本研究将为研发新型抗凝药物和维生素K拮抗剂的解毒剂提供理论指导。

华法林是治疗血栓性疾病的常用抗凝药，其靶点是人维生素K环氧化物还原酶（hVKOR）。hVKOR是维生素K循环的限速酶，但其催化机制还不清楚，且华法林抑制hVKOR的机制也存在争议。本项目利用细胞活性实验、凝胶迁移实验、蛋白质谱、蛋白结构解析和分子模拟等方法系统地研究了hVKOR还原维生素K环氧化物（KO）的机制、VKOR催化活性的结构特点，华法林抑制hVKOR的分子机制以及hVKOR活性中心活化的分子基础。首先我们建立了基于质谱技术的细胞内蛋白足迹方法，优化了糜蛋白胶内消化膜蛋白的方法，这些技术为本项目的顺利完成提供了保障。在细胞生理条件下，我们发现两种氧化还原态的hVKOR活性中心（还原态或部分氧化态）具有还原KO的活性，且它们对还原KO的贡献大致相同，但两种状态的催化效率不同，因此我们提出hVKOR的混合催化模型。我们还发现华法林抑制氧化态和部分氧化态的hVKOR，在此基础上，我们提出了华法林的混合抑制模型，即通过竞争性机制抑制部分氧化态的hVKOR，通过非竞争性机制抑制氧化态的hVKOR。通过比较SsVKOR和hVKOR的蛋白结构，和系统地改造SsVKOR，发现VKOR同源蛋白的底物结合口袋周围8个氨基酸和锚定结构域是决定它们KO还原酶活性的关键因素。通过比较hVKOR和VKORL1，我们发现这两个同源蛋白的外周区域是决定它们对华法林具有不同敏感性的结构特征。此外，在生理条件下，GSH可能是活化VKOR蛋白活性中心的还原性分子伴侣。这些结果加深了我们对VKOR的功能以及华法林抑制机制的认识，将为华法林的精准医疗和开发靶向VKOR的新型抗凝药提供理论指导。此外，我们自主探索了的凝血因子9信号肽和前肽错义突变导致乙型血友病的分子机制，并提出携带信号肽和前肽错义突变的患者可能通过口服维生素K改善其出血症状，这为乙型血友病的精准治疗探索了新的方向。