肝癌发生发展中唾液糖蛋白糖链标志物的筛选和鉴定

The persistent hepatic inflammation caused by chronic hepatitis B infection leads to liver fibrosis, progressive liver cirrhosis, and eventually, hepatocellular carcinoma (HCC). Liver cirrhosis is an important cause of death and a major risk factor for the development of HCC. Currently, one of the reasons for the high liver cancer mortality is that the final diagnosis of liver cancer is usually late and the best treatment period is missed.The histopathological examination is still the current gold standard for HCC diagnosis. Therefore, the new method of non-invasive examination in early stages of liver cancer to detect liver cancer markers from a human body fluid is the key to the prevention and control of liver cancer. The change of glycoprotein glycans in serum and liver tissue usually happens in the process of liver inflammation, fibrosis and HCC. This project is intended to screen and identify the common and specific glycoprotein glycans in saliva of hepatitis B, cirrhosis, liver cancer patients and healthy volunteers by the technology of glycomics, and research the alteration of glycoprotein glycans in saliv associated with development of HCC. Finally, the glycoprotein glycans with the high sensitivity, specificity and good reproducibility will be determined as the potential diagnostic markers of HCC. This study will provide a theoretical basis to distinguish among hepatitis, cirrhosis and HCC with the glycoprotein glycans from saliva as well as especially for the non-invasive early clinical diagnosis of HCC.

肝癌死亡率高的原因之一是肝癌的确诊通常是在晚期，错过了最佳的治疗时期，病理组织学检查仍是目前诊断的金标准。因此寻求非损伤性检查，进行肝癌早期诊断，是防控肝癌的关键。目前的研究工作表明在肝病的炎症、纤维化、癌变的过程中患者血清和肝组织中均伴有糖蛋白糖链结构的改变，但在患者的唾液中是否存在类似的糖链结构变化尚不清楚，是亟待研究的问题。本项目拟以乙型肝炎、乙肝后肝硬化和肝癌患者以及健康志愿者的唾液样本为研究对象，利用糖组学技术分析临床患者与正常对照样本中的糖蛋白糖链谱，筛选和鉴定乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液中共有的和特有的糖蛋白糖链，研究唾液糖蛋白糖链变化与肝癌发生发展的关联性。确定敏感性高、特异性强和重现性好的糖蛋白糖链为潜在的肝癌诊断标志物。本研究将为鉴别诊断肝炎、肝硬化与肝癌，尤其为非损伤性肝癌早期临床诊断提供理论依据。

本课题以乙型肝炎、乙肝后肝硬化和肝癌患者以及健康志愿者的唾液样本为研究对象，分析临床患者与健康对照样本的糖蛋白糖链谱，筛选并鉴定乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液中共有及特有的糖蛋白糖链，研究唾液糖蛋白糖链变化与肝癌发生发展的关联性，并确定敏感性高、特异性强和重现性好的糖蛋白糖链作为潜在的肝癌早期诊断标志物。在获得国家自然科学基金的资助后，本课题按计划实施，进展顺利，于不同阶段分别完成了临床样本采集；利用高覆盖率凝集素芯片技术对健康志愿者、乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者的唾液糖链表达差异进行了研究，经过个例唾液样本的凝集芯片进一步筛选，有14种凝集素（例如MAL-II, UEA-I 和 LTL）识别的糖链结构在健康志愿者、乙肝、肝硬化及肝癌患者之间存在显著差异，主成分分析显示乙肝、乙肝后肝硬化和肝癌患者唾液中，三者各自具有特异性糖蛋白糖链谱，而且肝硬化和肝癌患者糖链谱有重叠区，可用于肝癌的早期诊断。基于筛选出的14个凝集素，制备了乙肝相关肝硬化和肝癌鉴别诊断小型凝集素芯片，分别构建了乙肝、肝硬化和早期肝癌诊断数学模型，鉴别乙肝的灵敏度及特异性达到0.96和0.90，肝硬化的灵敏度及特异性达到0.94和0.82，肝癌的灵敏度和特异性达到0.94和0.84。经临床验证，具有良好的诊断效果。为验证该模型针对于诊断乙肝、肝硬化、肝癌的特异性，我们利用凝集素芯片对胃癌、乳腺癌、卵巢癌等典型癌症患者的唾液糖链表达差异进行了筛选验证，分析并建立了对应诊断模型，验证了乙肝、肝硬化、肝癌诊断模型的特异性。在此基础上，通过制备一系列凝集素（MAL-II、SNA、PHA-E+L、LTL、DSA）磁性微粒复合体，对乙肝、肝硬化、肝癌患者及健康志愿者唾液中对应糖蛋白进行分离纯化并获取对应糖链，利用MALDI-TOF/TOF-MS技术对糖链进行分析，鉴定获得乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液中共有及特有的糖蛋白糖链，这些特殊表达于肝癌、肝硬化患者唾液中的糖链，均具有成为诊断对应肝病的生物标志物的潜力。