蛋白质磷酸化调控宰后肌肉肌原纤维蛋白降解机理

Degradation of myofibrillar proteins by calpain is one of the most important influence factors on meat tenderness. Both μ-calpain and myofibrillar proteins in skeletal muscle have been proved that they can be phosphorylated during postmortem and phosphorylation affects degradation of myofibrillar proteins by μ-calpain. However, the effects and mechanisms of phosphorylation on the degradation of myofibrillar proteins via μ-calpain is still unknown. Therefore, the purpose of this project is to analyze the effect of phosphorylation on the activity of μ-calpain and the degradation of myofibrillar proteins, and the phosphorylation levels and phosphorylation sites of μ-calpain and myofibrillar proteins in skeletal muscle. The effects of phosphorylation of μ-calpain, phosphorylation of myofibrillar proteins, and phosphorylation of both μ-calpain and myofibrillar proteins on the degradation of myofibrillar proteins via μ-calpain will be studied. The interaction, the conjugation area and sites between μ-calpain and myofibrillar proteins will be investigate. Finally, the effects of phosphorylation on the conformation of μ-calpain and myofibrillar proteins will be analyzed, and the impact of conformation changes on the activity of μ-calpain and the stability of myofibrillar proteins will be confirmed. Above all, the mechanism of the effect of phosphorylation on the degradation of myofibrillar via μ-calpain can be clarified according to the conclusions of this project.

钙蛋白酶嫩化理论认为钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白改善宰后肌肉嫩度，研究表明宰后肌肉中μ-钙蛋白酶及肌原纤维蛋白均存在磷酸化修饰现象，磷酸化修饰参与调控μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白过程，但调控机理尚不清楚。本项目以宰后骨骼肌为实验材料，分析磷酸化对宰后μ-钙蛋白酶活性及肌原纤维蛋白降解的影响，确证宰后μ-钙蛋白酶及肌原纤维蛋白磷酸化水平变化及磷酸化位点；利用离体模型，从酶磷酸化、底物磷酸化及酶和底物均磷酸化三个角度，解析磷酸化修饰对μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白的影响程度、影响区域及结合靶点；分析磷酸化对μ-钙蛋白酶及肌原纤维蛋白构象的作用，揭示构象变化对μ-钙蛋白酶活性及肌原纤维蛋白稳定性的影响机制，揭示磷酸化修饰调控μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白作用机理，为磷酸化修饰调控肌原纤维蛋白降解进而调控肉品嫩度提供理论依据。

我国是畜禽肉生产和消费大国，嫩度是评价肉品品质的一个重要指标。肌原纤维蛋白被降解是促进宰后肌肉嫩化的主要因素，钙蛋白酶是降解肌原纤维蛋白主要的限速酶。磷酸化是一种典型蛋白质转录后修饰方式，嫩度不同的肌肉中多种肌原纤维蛋白的磷酸化水平不同，因此分析宰后肉的蛋白质磷酸化水平，明确磷酸化如何通过影响μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白降解影响嫩度具有重要意义。本项目以羊肉研究对象，分别建立了高中低嫩度羊肉组、μ-钙蛋白酶抑制羊肉组、蛋白激酶或磷酸酶抑制羊肉组，采用SDS-PAGE、LC-MS/MS、免疫印迹、扫描电镜等方法，阐明了宰后不同嫩度肉中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白磷酸化水平变化规律，明确了宰后肉嫩度和蛋白质磷酸化的关系，确定了μ-钙蛋白酶对肌原纤维蛋白降解的目标蛋白，揭示了蛋白质磷酸化通过抑制肌原纤维蛋白降解进而不利于宰后肉嫩化；在此基础上，建立离体模型，通过蛋白激酶和磷酸酶催化磷酸化反应和去磷酸化反应，分析磷酸化对μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白的作用机制，揭示了蛋白质磷酸化通过作用于μ-钙蛋白酶识别肌原纤维蛋白的PEST区域和改变肌原纤维蛋白结构进而抑制μ-钙蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解。该研究丰富了传统的钙蛋白酶嫩化理论，将宰后肉嫩度的研究从酶降解底物的水平深入到了蛋白质修饰的水平，为生产高品质肉奠定了理论基础。