利用CRISPR-cas9系统筛选和解析与癌症发生发展相关的增强子

Genome wide association study (GWAS) and whole genome sequencing (WGS) data demonstrate that mutations in enhancers are related with cancer, but it remains unclear which enhancers are expressed in cancer cells and what roles enhancers play during carcinogenesis. In this project, first we use bioinformatic analysis to combine the dimensional genomic data to obtain a cancer-related enhancer list, which includes more enhancers in more cancer types. About 1000 enhancers above will be knocked-out in parallel using CRISPR-cas9 system. A lentivirus library including a pool of paired sgRNAs targeting enhancers will be used to screen different phenotypes (such as cell proliferation, metastasis, and drug resistance) in different cancer cell lines. Combined with next-generation sequencing technology, enhancers regulating the phenotypes will be characterized. The expression pattern of enhancers and the transcriptional regulation of target genes in different cancer cell lines will be compared. Experiments of molecular biology and cell biology will be carried out to delineate the regulatory mechanism of enhancers in carcinogenesis. The investigation of enhancers in this project will broaden our insights in the transcriptional regulation in cancer cells and develop new strategies for cancer diagnosis and therapy.

全基因组相关性分析和全基因组测序数据显示增强子的突变与癌症的发生发展相关，但是目前对增强子在癌细胞中的活性（表达）和增强子在癌症发生发展过程中的作用尚不清楚。本项目首先借助生物信息学分析，通过整合多维基因组数据，获得较全面覆盖多种癌症类型的、在癌细胞中表达的增强子列表。在此基础上借助CRISPR-cas9技术，通过构建靶向上千个增强子的成对sgRNA慢病毒库，实现在癌细胞系中的大规模平行筛选。与二代测序技术结合，鉴定与特定表型（如细胞增殖、迁移、抗药性等）相关的增强子，通过比较不同细胞系和不同表型间增强子的异同，解析增强子表达和对靶基因表达调控的普遍性和特异性。结合分子生物学和细胞生物学实验等，进一步解析筛选得到的某些增强子在癌症发生发展过程中的作用机制。本项目对增强子深入全面的研究，将深化对增强子在癌症发生发展过程中作用的认识，并为制定癌症诊断和治疗方案提供新的视角。

尽管全基因组关联分析显示增强子在癌症发生发展过程中扮演重要角色，但是相关增强子的鉴定并不充分，它们的调控机制也远远未被充分解析。本项目首先通过多维基因组数据的整合分析，筛选获得泛癌水平与癌症发生发展紧密相关的增强子列表，并成功构建了靶向上述其中一千个增强子的成对sgRNA慢病毒文库；接着利用CRISPR-cas9实现了在不同癌细胞系中的大规模平行筛选；借助二代测序技术，分析了非小细胞肺癌细胞系A549和NCI-H1299相关的不同基因型细胞和不同时间点sgRNA的种类和数量分布；进一步解析了两种癌细胞中与生存/增殖紧密相关的增强子，以及与癌基因cMYC互作的增强子；通过比较这两种癌细胞系相关的不同基因型细胞间以及不同时间点间筛选得到的增强子列表，细致描述了相应增强子对靶基因表达和表型调控的普遍性和特异性。我们筛选得到的这些增强子及预测的它们调控的相关靶基因，将为癌症相关的增强子研究提供可靠的资源和研究的起点。此外，它们作为潜在的癌症治疗靶点，对它们调控机制的深入研究将帮助提高癌症的治愈率和降低复发率。在整合多维基因组学数据分析的基础上，进一步结合分子生物学和细胞生物学等实验技术，我们解析出增强子enh9通过调控不同靶基因的表达分别实现对癌细胞增殖和迁移能力的调控，从而实现了对增强子enh9在癌症发生发展过程中调控分子机制的探究。此外，在项目执行期间，我们围绕癌症的调控机制，开展了一系列研究，如转录调控网络的稳定性维持、癌症内和癌症间的异质性、焦亡在泛癌水平与癌症发生及免疫反应之间的相关性等。这些研究都将帮助我们更加立体全面得了解癌症的发生发展过程，为探寻全新的广谱杀伤肿瘤的措施和有效的个体化癌症治疗方案提供新的视角和策略。