基于赤芝与紫芝全基因组比较阐明灵芝三萜类物质合成途径

灵芝素有"仙草"的美誉，是我国传统名贵中药。其中赤芝的灵芝酸含量较丰富，而紫芝中含量甚微，本课题由此提出对二者基因组进行比较分析，发掘灵芝酸合成途径下游关键酶基因（包括p450羟化酶和三萜糖基转移酶基因），揭示灵芝三萜类物质合成途径的分子基础。利用Roche GS FLX和ABI SOLiD两大高通量测序技术，申请人已经获得赤芝和紫芝的全基因组序列，并对两个物种基因组进行了注释。本研究将通过比较基因组学发掘可能参与灵芝酸合成途径的p450羟化酶和三萜糖基转移酶。主要研究内容包括：（1）比较分析两个物种基因组信息；（2）挑选可能参与灵芝三萜合成的p450羟化酶和三萜糖基转移酶基因；（3）利用营养缺陷型酵母菌株验证候选基因功能，为体外重建灵芝三萜类物质合成途径奠定理论基础。

赤芝和紫芝是我国传统中药灵芝的两个主要种类。本课题对赤芝和紫芝基因组分别进行分析以期揭示灵芝三萜类物质生物合成过程。利用二代测序技术和光学图谱技术测得赤芝基因组43.3 M，预测含有16,113个基因。序列分析结果显示有一系列编码CYP450、转运体和调控蛋白的基因。赤芝基因组是目前已测序担子菌基因组中，含有最丰富的木质素降解酶类基因的基因组。从中鉴定出24个CYP450基因簇。78个CYP基因跟LSS共表达，其中16个CYP基因与特异参与睾酮羟化途径的CYP基因相似度极高，它们可能参与真菌中三萜类物质的生物合成。紫芝基因组共有48.96 M，包含12条染色体和15688个基因。有超过30个基因家族参与到次生代谢合成过程，鉴定到大量负责次生代谢物的转运和调控的基因。而且从紫芝基因组中发现，真菌为了避免遗传不稳定性和别的生物侵袭，发展出一套强有力的遗传和化学的防御机制。这套机制包括：重复序列诱导的点突变RIP（repeat-induced point mutation）、DNA甲基化和小RNA介导的基因沉默。系统生物信息学研究表明，基因组数据和甲基化组数据证明RIP和DNA甲基化，通过抑制外来物种的遗传侵略和转座等方式共同维持了紫芝基因组的稳定性。通过对紫芝基因组和表观基因组的阐述，它们提高了我们对次生代谢过程和真菌防御机制的认识。另外还发现，赤芝中出现了大量具有选择性的RNA编辑现象。在本项目中我们对具有珍贵药用价值的赤芝在基因组水平筛选了RNA编辑位点。从赤芝的基因组和转录组数据一共找到8906个可能的RNA编辑位点，包括外显子、内含子、2991个基因的5’和3’非翻译区和一些基因间区。主要的编辑类型包括C→U，A→G，G→C和U→C这四种转换。鉴定到四种RNA编辑需要的酶，包括三个作用于tRNA的腺苷脱氨酶和一个脱氧胞苷酸脱氨酶。通过GO和KEGG数据库对含有RNA编辑位点的基因进行功能分类。富含RNA编辑位点的功能基因主要包括编码参与木质素降解的漆酶基因，以及三萜合成关键酶基因和转录因子。随机挑选了97个编辑位点利用PCR和Sanger测序法进行验证。在本研究中，我们获得了灵芝基因组水平的大规模且精确的RNA编辑位点信息，这为揭示RNA编辑对灵芝生长发育及次生代谢途径的调节以及对环境响应等方面的机制提供理论基础。